动物疫病鉴别检测技术 第2部分：兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒2型-地方标准编制说明

1《动物疫病鉴别检测技术第2部分：兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒2型》地方标准编制说明一、工作简况（一）任务来源2019年9月4日，山东省市场监督管理局发布《2019年度标准化综合改革暨“山东标准”建设计划项目》（鲁标改办发〔2019〕6号），本标准任务来源于其中的“乡村振兴标准化建设项目”，名称为“兔病毒性出血症Real-timeRT-PCR检测方法”，由山东省畜牧兽医局提出并组织实施、山东省畜牧业标准化技术委员会归口，山东省滨州畜牧兽医研究院牵头组织编制。（二）起草单位、起草人及任务分工本标准起草工作由山东省滨州畜牧兽医研究院、山东绿都生物科技有限公司、山东省农业科学院家禽研究所等单位承担。本标准制定首先成立了标准起草小组，拟定了标准起草工作方案、技术路线、人员分工和计划进度等，具体人员分工如下。2标准制订负责统筹协调、标准起草与修改技术与标准起标准品的制备（三）起草过程1、材料收集2019年检索和查阅国内外相关文献资料，搜集了相关畜禽疫病诊断的国家标准、行业标准、地方标准及团体标准等，根据兔出血症病毒（Rabbithemorrhagicdiseasevirus,RHDV）经典型与出血症病毒2（Rabbithemorrhagicdiseasevirustype2,RHDV2）变异型流行毒株及病毒基因组序列差异性的特点，分析比较了现有动物疫病检测方法的优、缺点，确定了实时荧光反转录-聚合酶链式反应（Real-timeRT-PCR）是适合实验室的检测方法。32、病原与流行病学调查本项目组自2006年以来，一直开展RHDV经典型与RHDV2变异型的流行与跟踪研究，对其临床症状、流行病学、临床发病特点、病毒遗传进化演变、综合防控技术进行了深入研究。项目组对国内46株RHDV经典毒株主要结构蛋白VP60的基因序列或者基因组进行了研究分析，抗原性未发生重大变异。法国于2010年首先报道了RHDV2新型变异株，不仅导致育肥兔大量死亡，以RHDV经典型制备的灭活疫苗无法提供完全保护，免疫兔群死亡率高达25%，可见，其抗原性产生较大变异。之后RHDV2型在欧洲、非洲、大洋洲部分国经典型成为主要流行毒株。我国于2020年5月份在四川省确诊了由RHDV2型引发的疫病，与荷兰报道的NL2016毒株（GenBank登录号：MN061492）同源性最高为98.3%。我国作为世界第一养兔大国，若该变异毒株发生大规模流行，势必加大防控难度。因此，建立一种可以通用并鉴别RHDV经典型与RHDV2型的检测技术极为重要。3、检测方法建立与复核2018-2019年通过对本项目组获知的11株病毒的基因序序列进行比对分析，根据病毒VP60基因的保守区域分别设计了3对Real-timeRT-PCR组合引物，经敏感性、特异性、重复性及扩增产物Tm值差异等验证，筛选出1对最佳引物，4对反应条件进行了优化，建立了一种敏感、特异、快速、操Real-timeRT-PCR检测方法，并进行了大量的临床检测应用验证，确保方法的准确性。将该鉴别检测技术实施标准化后，委托4家单位开展对《动物疫病鉴别检测技术第2部分：兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒2型》标准进行相关样品复核验证，反馈结果表明：标准文件中鉴别检测技术敏感、特异，具有很好的重复性，可有效鉴别检测RHDV经典型与4、标准编写过程2019年11月-2019年12月，成立标准起草组，召开项目协调会，根据前期调研论证和检测方法建立的结果，开始编写《动物疫病鉴别检测技术第2部分：兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒2型》的征求意见草案稿。2020年1月-2020年6月，根据我国流行毒株情况，进行了进一步试验验证及相关数据分析，对征求意见草案稿进行修订、完善，形成《动物疫病鉴别检测技术第2部分：兔出血症病毒经典型与兔出血症病毒2型》的征求意见稿。2020年7月-2022年2月，对征求意见稿进行项目专家函审，广泛征求意见；收集、汇总专家修改意见，形成了标准预审征求意见。继续反复试验验证，完善检测技术方法，根据草案稿函审意见对此标准进行了修改与完善，形成《动5物疫病鉴别检测技术第2部分：兔出血症病毒经典型与兔依据专家意见对标准及编制说明文本进行修改。2023年2月，召开地方标准审查会议，邀请9位专家对标准案进行整体审查，包括题目、前言审查，范围、规范性引用文件、术语与定义等审查，试剂或材料、仪器设备审查，结果判定审查，附录审查及检测技术审查。2023年3月-2023年7月，依据专家审查会意见对标准及编制说明文本进行修改与完善，形成《动物疫病鉴别检测报批稿，并申请山东省地方标准报批。二、地方标准制定目的和意义兔出血症（Rabbithaemorrhagicdisease，RHD）首发于我国江苏，是目前困扰我国养兔业健康发展最为重要的病毒性疫病，是由兔出血症病毒引起的表现为发病急、突然死其中ORF1占比94%，编码多聚蛋白，被裂解为多个非结构蛋白与主要结构蛋白VP60，ORF2与ORF1部分重叠，编码次要结构蛋白VP12；同时，病毒粒子还含有约2.2kb的亚基因是主要免疫保护性蛋白，主导了病毒抗原性演变，是新型疫6苗研制、检测试剂开发的重要靶标。RHDV经典型被分为RHDV原始群（OriginalRHDV）与变异群（RHDVa国内目前流行的以RHDVa为主。RHDV2是2010年在法国开始出现的新型变异毒株，不仅导致育肥兔大量死亡，还可以导致免疫了RHDV经典型疫苗的兔群病死，死亡率高达25%，之后在欧洲、非洲、大洋洲部分国家流行。我国四川省已经确诊了该型病毒，无疑加重了其在我国的防控难度，开发快速、敏感、特异的检测试剂，尤其是既可以通用、又可以鉴别的检测方法具有重要意义。序列分析显示，RHDV经典型与RHDV2型VP60基因核苷酸序列同源性仅为81%左右，因此，现有的针对RHDV经典型VP60基因的分子生物学检测方法可能因引物序列与RHDV2型VP60基因无法完全匹配而导致对后者的检测敏感性大幅度降低，甚至无法检出。因此，急需建立一种敏感、特异、快速、操作简便、易于判定的通用鉴别检测RHDV经典型与RHDV2型的荧光定量RT-PCR检测方法，目前国内外还没有该方法的诊断标准。基于此，过比较分析RHDV经典型与RHDV2型VP60基因序列，设计引物并建立了基于SYBRGreenI染料的荧光定量RT-PCR检测方法，同时，通过比较扩增产物熔解曲线Tm值的差异，通用、鉴别检测RHDV经典型与RHDV2型，在此基础上制定该标准。三、地方标准编制原则、主要技术内容和确定依据7（一）标准的编写原则1部分：标准化文件的结构和起草规则》与《标准化工作导则第2部分：标准中规范性技术要素的确定方法》给出的规定起草，主要遵循“规范性、实用性、统一性和协调性”的原则，注意标准的经济性和社会效益。1、规范性本标准针对开展RHDV经典型与RHDV2型检测的文件使用者原则，从操作过程到结果判定均给出了明确的规范，保证了规范性要素中的内容是特定使用者所需要的。2、实用性文件内容的表述便于直接应用于RHDV经典型与RHDV2型的检测。3、一致性和协调性本标准各部分之间，关于RHDV经典型与RHDV2型检测的结构表述一致，能够帮助文件使用者理解文件；同时，与现行有效的文件相互协调，没有重复和不必要的差异。（二）主要技术内容和确定依据本标准样品的采集、保存和运输，以及各种试验条件优化与参数确定等，凡是未特别描述的均参照NY/T541《兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》标准与文献（肖跃强，孙培姣，周迎春等.鉴别RHDV与RHDV2荧光定量RT-PCR检8报,2021,43(05):512-520）。本标准制定的Real-timeRT-PCR检测方法，最大特点型。本标准方法建立时首先设计3对组合引物，序列见表1，对RHDV经典型与RHDV2型通用扩增、扩增产物Tm差异筛选VP60-F1244/VP60-R1393组合，熔解曲线Tm值差异分析见图2，继而通过体系反应条件优化建立了检测方法。该方法敏感性好，对RHDV经典型与RHDV2型质粒标准品敏感性均为1×101拷贝，如图3所示；该方法特异性好，仅对RHDV经典型与RHDV2型扩增阳性，对猪瘟兔化弱毒（脾淋源）、兔多杀性巴氏杆菌、兔A型魏氏梭菌、兔波氏杆菌均为阴性，如图4所示；该方法重复性好，对RHDV经典型扩增的批内和批间Cp值最大变异系数分别为1.91、3.60，Tm值最大变异系数分别小于0.72、0.48，对RHDV2型扩增的批内和批间Cp最大变异系数分别为1.90、3.93，Tm值最大变异系数分别为0.29、0.17；该方法通过Tm值即可实现RHDV经典型与RHDV2型鉴别检测，临床样品检测结果显示，RHDV经典型与RHDV2型扩增产物Tm值一般相差1.5℃~2.5℃,Tm值比较见表2；同时用2家公司市售主流病毒核酸提取试剂盒提取RHDV与RHDV2基因组RNA，然后分别进行3次重复检测，结果见表3，可见，无论是扩增Cp值还是扩增产物Tm值均无显著差异；同时，对人工感染RHDV的实验兔样品检测，肝9脏、肺脏、脾脏、肾脏、心脏、内皮、肌肉组织样品等检测均为阳性，以肝脏Cp值最小，即病毒含量最高，其它脏器组织Cp值依次升高，对口鼻粘液、肛肠排泄物、尿液排泄物的检测也均为阳性，其中口鼻粘液的带毒量高于肛肠排泄物与尿液，如图5所示。VP60-F1081TGGAACAGTAACARCGGTGCCCVP60-R1218GGCATAAATGGACTTRGCGACAGVP60-F1252CTGTTTGTGATGGCMTCGGG X±SD X±SDZar2016_4RHDVAV34111---0---表3市售病毒核酸提取试剂盒检测比较结果Cp值平均数(X±SD)Tm值平均数(X±SD)A：不同引物组合扩增RHDVCp值与熔解曲线；B：不同引物组合扩增RHDV2Cp值与熔解曲线81-7：依次代表1×107～1×101拷贝/μL荧光定量PCR扩增；8：阴性对照RHDVRHDV2猪瘟兔化弱毒兔多杀性巴氏杆菌兔A型魏氏梭菌兔波氏杆菌阴性对照1～10：肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、心肌组织、内皮组织、口鼻粘液拭子、肌肉组织、肛门拭子、尿液样品荧光定量PCR检测曲线；11：阴性对照图5病毒组织分布与排毒荧光定量PCR检测四、与现行相关法律、行政法规和其他标准的关系原微生物实验室生物安全管理条例》、《行业标准管理办法》和《山东省地方标准管理办法》等相关法律、法规、文件规本标准制定时参考了GB/T6682《分析实验室用水规格和试验方法》、DB63/T1652《病害动物及病害动物产品无害化处理技术规程》与NY/T541《兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范》。目前，国际上无RHDV经典型与RHDV2型通用、鉴别荧光定量RT-PCR诊断技术相关标准。本单位承诺该标准不