《仪器分析》第六章++色谱分析导论

色谱分析导论色谱法及其分类色谱流出曲线和术语色谱分析基本原理1色谱法及其分类（1）定义：

色谱法是一种物理化学分离和分析方法。它是基于物质溶解度、蒸汽压、吸附能力、立体化学或者离子交换等物理化学性质的微小差异，使其在流动相和固定相之间的分配系数不同。当两相做相对运动时，被分离物质在两相之间进行反复多次分配，这样原来微小的分配差异产生了很大的效果，使各组分分离，从而达到分离、分析以及测定一些物理化学常数的目的。（2）历史：色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）于1906年提出的。现代色谱方法的分离与检测是在线连续进行，记录时间－组分浓度信号图即色谱图。固定相流动相（3）分类：

（a）按照流动相和固定相物态分：气相色谱：气-固，气-液液相色谱：液-固，液-液超临界流体色谱

（b）按照分离原理分：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱凝胶色谱、生物亲和色谱

（c）按照分离系统的结构形状分：柱色谱、毛细管色谱、平板色谱

（d）按照展开程序分：洗脱法、顶替法、迎头法洗脱法吸附或溶解能力比样品弱的物质作为流动相，利用组分在固定相上溶解能力不同实现分离。洗脱法样品流出曲线大部分色谱过程采取这种方法。样品区带呈高斯分布。tA顶替法在惰性流动相中加入对固定相吸附或者溶解能力比所有组份都强的物质为顶替剂（或者直接用顶替剂做流动相。适合于制备纯物质或者浓缩分离某一组份，缺点是每经一次使用后，必须更新柱子顶替法样品流出曲线迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱。除第一组份外均非纯物质，因此仅适用于从含微量杂质的混合物中切割出一个纯组份。迎头法样品流出曲线2色谱流出曲线和术语非滞留组分基线色谱峰峰高区域宽度：标准偏差

；半峰宽W1/2；峰底宽W（W1/2=2.354

；W=4

）

保留值：死时间tm；保留时间tR；调整保留时间tR’；死体积Vm；保留体积VR；调整保留体积VR’相对保留值分离度

由色谱峰流出曲线可以实现以下目的：

依据保留值进行定性；依据峰面积或者峰高进行定量分析；依据保留值以及峰宽评价色谱柱的分离效能3色谱分析基本原理问题：色谱峰为什么是这种形状？不同物质为什么保留值不同？相邻的峰分离效果如何表示？和什么因素有关？如何提高分离速度？

……样品在色谱柱内运行有两个基本特点：不同组分分子差速迁移-物质在两相中的分配平衡，热力学同种组分分子分布离散-物质在流动相、固定相中的扩散和运输速率以及柱外效应，动力学色谱学研究的两个基本问题：热力学、动力学（1）分配过程流动相固定相V色谱柱内的分配平衡相转移力：热力学理论告诉我们，自发过程总是向自由能减少的方向进行的。而化学势（偏摩尔自由能）可以用来判断相变化和化学变化的方向，即物质总是从化学势高的状态变到化学势低的状态，直至化学势相等即达到平衡状态。因此，组分在两相之间的化学势之差就是发生相转移变化的推动力。溶质在流动相和固定相中的化学势分别为：平衡状态下溶质在两相中的化学势相等，即由于色谱体系中溶质量很小，一般做稀溶液处理，活度可以用浓度C代替，从而可得到：分配系数K：

定义为组分在固定相中和流动相中的浓度之比，因此有：（1-5）

物质的化学势实际上等于其偏摩尔自由能，因此可得：（1-6）

分配系数K是溶质在两相中的分布平衡性质的量度，反映了溶质和固定相、流动相作用力的差别，它决定于流动相、固定相和溶质分子的结构，而和色谱柱特性以及仪器无关。分配比色谱学中用到的描述溶质在固定相和流动相之间分布特性的另一个重要的参数是分配容量k’，也叫容量因子，分配比，容量比。相比

（1-8）

相比与填料的颗粒度、表面积、固定相的用量、填充的情况等因素有关！（2）保留值保留值是组分在色谱柱内滞留行为的一个指标，与分配过程有关，受热力学和动力学因素的控制。保留时间、保留体积等。

基本保留方程为：

组分在色谱柱内停留的时间tR可以看成两部分：停留在流动相里面的时间t0–受流动相流速的影响，与组分的分配保留无关停留在固定相里面的时间t0

k’–决定于分配比，即分配系数以及色谱柱的结构参数相对保留值：代表固定相对两组分的分离能力即分离选择性的大小。取决于：固定相性质与流动相性质柱温

（3）色谱过程基本理论色谱过程理论需要解决的问题：组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？影响分离效果的因素及改进途径？

色谱分离过程的热力学和动力学问题，柱效与分离度的评价指标及其关系。1940年Wilson提出了平衡色谱理论。对于谱线移动的速度和非线性分配等温线时的流出曲线形状给了很好的说明。由于该理论忽略了传质速率的有限性与物质分子的纵向扩散的影响，因而对在线性色谱条件下的色谱峰区域扩宽的现象不能解释。1941年，Martin和Synge提出塔板理论。对色谱流出曲线分布和谱带移动规律，以及柱长和理论塔板高度H对区域扩张的影响给予了近似的解释。但是塔板理论对影响理论塔板高度H的各种因素没有从实质上进行考虑，只是一个半经验的理论，未能掌握色谱过程中区域扩张的实质。20世纪50年代，vanDeemter等提出了速率理论。同时考虑传质速率和纵向扩散互相影响的关系式并不断得到发展，统称为速率理论，可以更好地阐明各种操作参数对柱效能与峰形的影响。1）平衡色谱理论基本假设：组分以脉冲的形式进入色谱柱，组分在两相之间的分配平衡瞬间达成。即不考虑传质速率的有限性和物质的扩散对平衡过程的影响。dxc+dcc(c+dc)puqdt

=pqdxcpuqdt流动相固定相q

=(1-p)qdx2）塔板理论塔板理论就是将色谱柱和蒸馏塔进行类比为基础的半经验理论，并且得到了广泛的应用。塔板理论假设如下：（1）虽然物质在两相之间的平衡实际上不能瞬间达到，但从统计的角度来看，可以认为平衡能够在一个小段色谱柱内形成。这一小段色谱柱称为一个理论塔板，其相应占有的色谱柱长称为理论塔板高度（H）。整个色谱柱由一系列按顺序排列的塔板组成。在这一小段塔板内，K为平衡时物质在两相间的分配浓度比即分配系数。（2）假设在柱内塔板高度为常数，长度为L的色谱柱内塔板数目为n=L/H。（3）假定流动相不是采取连续的方式前进，而是跳跃式前进。设q和p分别是柱的横截面积和在柱横截面积中流动相所占据的截面积分数，那么一个塔板上流动相所占据的空间体积为Hqp。当通过色谱柱的流动相体积为V时，相当于流动相在整个柱内每个塔板上跳动的次数为r=V/Hqp。（4）流动相不可以被压缩。（5）塔板编号依次为0，1，2，3，

n，总塔板数为n+1，实际上n很大，所以总塔板数约等于n。（6）全部样品开始都集中在第一块塔板上。（7）分配系数不随组分浓度变化，即分配等温线是线性的。

（8）塔板之间没有分子扩散。基本关系式

在塔板上，某一个分子出现在流动相中的概率（Pm）应等于在该塔板上流动相中该物质分子的个数（摩尔数）与整个塔板上（包括流动相、固定相）该物质分子的个数之比，因此有：经过r次跳跃后，各塔板上溶质的分布可以用二项展开式来描述。根据上面的式子可知，经过r次跳跃后在第n块塔板上出现的概率P(r,n)（r

n）为：塔板理论的保留值组分在柱后出现浓度极大值时，意味着该组分分子在色谱柱最后一块塔板上的量达到极大（每块塔板体积相等）。设此时流动相在色谱柱内相应的跳动次数为rmax，则应该满足以下条件：因为色谱柱的塔板数n值通常在数百至数十万之间，而r的值比n更大得多，因此可以得到：因为每一次跳动通过色谱柱的流动相体积等于一个塔板上占据的流动相的体积Hqk，所以保留体积等于跳动次数与Hqk的乘积，和平衡色谱理论的结果一致。塔板理论的色谱流出曲线方程上面的式子不够直观，因此需要进行适当的数学变换。当二项式分布的n，r很大时，可以用正态分布函数来表示：当足够量的流动相（r足够大时）经过色谱柱后，溶质开始从柱后流出并进入检测器产生响应讯号。进入检测器的溶质量等于第r次跳动（流动相体积为V）分布在最后一块塔板上的流动相中溶质。可知进入检测器的溶质浓度为：流出曲线方程或者是塔板理论方程。塔板高度和理论塔板数的计算方法根据色谱峰呈Gaussian分布曲线可以导出计算理论塔板数的另一个公式。因Gaussian曲线不同高度上的相对宽度，即色谱区域宽度能够用标准偏差

来衡量，色谱峰的峰底宽W=4

，因此：每米柱长上的理论塔板数，定义为色谱柱效，以n’=n/L表示。它是评价色谱柱效能的指标。采用塔板数评价柱效时，须注意标明：组分固定相及其含量流动相及其操作条件柱温

塔板理论小结导出了色谱流出曲线方程，初步阐明了溶质分布随流动相体积变化的规律，给出了保留值的关系式、计算色谱柱效的方法以及色谱峰区域宽度的关系式。不能解释不同流动相流速下同一溶质将给出不同的理论塔板数。没有阐明理论塔板数和塔板高度的色谱含义和实质。没有深入讨论影响塔板高度的因素，对色谱体系的设计、操作条件的选择的指导意义十分有限。3）速率理论

1956年VanDeemter等人提出速率理论，Giddings等进一步加以完善。它将塔板理论中的塔板高度概念与组分在两相间的扩散传质联系起来，采用随机模式描述组分在柱内的分离过程。随机过程总是导致Gaussian分布，采用标准偏差

或者

2作为溶质分子在色谱柱内离散的度量。总的离散程度应该是单位柱长分子离散程度的累计，且与柱长成正比：比例因子H为单位柱长的分子离散：为了简便，H仍然称为理论塔板板高度，简称板高。色谱柱中并不存在所谓的塔板，在速率理论中，理论塔板高度是色谱柱内一个小单元中溶质分子离散的程度。作为一个色谱参数使用，是色谱峰扩张的指标。塔板高度的统计意义色谱过程中存在多种无规则的分子运动状态，引起色谱区带扩张。根据随机理论，有限个独立随机变量和的方差等于它们的方差和。色谱过程总的色谱区带扩张等于各个独立因素引起色谱区带扩张的和，即各独立离散项具有加和性：涡流扩散

采用细而均匀的填料，均匀填充可降低涡流扩散。

纵向分子扩散

Dm与分子量有关，N2、H2；液相Dm小。

流动相传质阻力

abc固定相传质阻力

流动相流动相固定相固定相多孔填料时可以用dp代替df。

VanDeemter速率理论方程填料粒度与填充情况扩散系数流动相线速固定相用量组分分配比哪些方法可以提高柱效？H~u曲线判断色谱柱填充情况比较色谱柱性能根据VanDeemter方程可以求出Hmin和uopt：例题:载体粒度由60目改变为100目，若其它条件不变，H~u曲线有何变化，为什么？答在其它条件不变的情况下，填料粒度由大变小时（60目变成100目），涡流扩散项因子A变小，纵向扩散项因子B基本不变，流动相传质阻力项因子C减小。