病理检验技术（第3版）课件 第11章 细胞和组织化学技术

第十一章细胞和组织化学技术1第十一章细胞和组织化学技术

学习目标1.了解细胞和组织化学方法的范围和种类、酶的种类。2.熟悉细胞和组织化学方法的基本技术和注意事项、光镜酶组织化学技术的基本程序、酶组织化学技术的染色方法。3.掌握核酸的显示技术和碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡糖-6-磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶、非特异性酯酶、琥珀酸脱氢酶的显示技术。2第一节细胞和组织化学技术概述一、细胞和组织化学方法研究的范围细胞和组织化学方法研究的内容有狭义和广义之分。狭义的细胞和组织化学方法只研究核酸和酶的显示与检测；而广义的细胞和组织化学方法则显示和检测组织细胞内的所有物质。3第一节细胞和组织化学技术概述二、细胞和组织化学方法的分类（一）化学方法（二）类化学方法（三）物理学方法（四）应用物理化学特性的方法（五）应用生物学特性的方法（六）显微烧灰法4第一节细胞和组织化学技术概述三、细胞和组织化学技术的基本要求1.要保持组织细胞的生前结构2.需保存细胞和组织中的化学成分以及酶的活性，以保证进行定量研究3.所用的方法要有高度的特异性4.所用方法应有一定的灵敏性5.实验要有可重复性5第一节细胞和组织化学技术概述四、细胞和组织化学方法注意事项1.组织材料切片和染色要及时。2.选择的试剂必须是分析纯（Ａ.Ｒ）,试剂的称量和配制要准确，酶组织化学中试剂和作用液的PH更需精确测量。3.实验所用器皿要充分清洗以保持清洁。使用的蒸馏水应为双蒸水。4.严格控制好反应物质的浓度、反应时的温度、试剂的PH以及反应时间，以保证良好的染色效果。5.必须做对照实验，正确分析实验结果，注意识别假阴性和假阳性。6一、Feulgen-Rossenbeck改良DNA显示法

［染色原理］

切片先经稀盐酸处理，使细胞内DNA水解，DNA分子中嘌呤碱基和脱氧戊糖之间结合断开，暴露出戊糖上的醛基，再用Schiff液处理，后者与醛基结合形成紫红色反应产物，从而显示出DNA。

［试剂配制］

［染色步骤］

第二节核酸（DNA、RNA）的显示技术7一、Feulgen-Rossenbeck改良DNA显示法

［结果］DNA被染成紫红色，细胞质及其他成分呈浅绿色。

［对照实验］

用1mg/mLDNA酶，37℃，消化切片2H后再染色DNA及细胞质均呈绿色。

［注意事项］

(1)Schiff试剂PH应调整为4.0。

(2)盐酸水解时，1mol/L盐酸必须事先预热至60℃，水解时间应视固定液而定，水解不足或过长均会影响染色效果。第二节核酸（DNA、RNA）的显示技术8二、Cook甲基绿派洛宁法

［染色原理］

甲基绿和派洛宁在水中电离后均带正电荷，前者碱性较强，带两个正电荷；后者碱性较弱，带一个正电荷。当染液PH为4.2时，DNA和RNA均带负电荷，但电荷数量不同。染色时，碱性强的甲基绿与DNA结合而显示为绿色，派洛宁则与RNA结合显示为红色。

［试剂配制］

［染色步骤］

第二节核酸（DNA、RNA）的显示技术9二、Cook甲基绿派洛宁法

［结果］

DNA染成绿色，RNA染成红色。浆细胞胞质呈红色或淡红色。

［注意事项］

（1）染色以后不能用水洗。

（2）丙酮分化时间不宜过长。

（3）样品若为骨组织，应调整染液比例，增加甲基绿的含量而减少派洛宁的含量。

（4）染液PH必须控制在4.8左右，不可偏高或偏低。

第二节核酸（DNA、RNA）的显示技术10第三节核仁组成区相关嗜银蛋白的显示技术一、AgNOR的石蜡切片经典染色法［试剂配制］[染色方法][结果]用100×油镜观察细胞核和胞质背景为淡黄色,AgNOR呈黑色颗粒状或黑色细小点状,分散于整个核仁之中。11第三节核仁组成区相关嗜银蛋白的显示技术二、AgNOR的石蜡切片李青改良染色浓(1993年)［试剂配制］[染色方法][结果]AgNOR呈黑色颗粒。12第三节核仁组成区相关嗜银蛋白的显示技术二、AgNOR的石蜡切片李青改良染色浓(1993年)［试剂配制］[染色方法][结果]AgNOR呈黑色颗粒。注意事项：(1)配制ARNOR染色液时,对硝酸银的质量要求高,不能潮解。(2)明胶的质量是影响非特异性银颗粒的重要因素。(3)AgNOR染色过程中,需严格控制时间和温度。13第四节光镜酶组织化学技术酶的概念：是生物体内具有催化作用的特异性蛋白质,在组织细胞内的生物化学反应过程都有酶的催化作用。酶的催化作特点：具有高度的特异性,一种酶只能催化一种底物或一组有关物质,并在酶具有活性的时候才能发挥作用。14第四节光镜酶组织化学技术一酶的种类，按照其催化性质分为六大类。（一）氧化还原酶如乳酸脱氢酶、SDH等。（二）水解酶如ARP、ACP等。（三）转换酶如Υ-GT等。（四）裂合酶如亮氨酸氨基肽酶、碳酸酐酶等。（五）异构酶如葡糖-6-磷酸异构酶等。（六）合成酶如三磷酸胞苷合成酶。15第四节光镜酶组织化学技术二酶的保存及影响酶活性的因素（一）酶的保存（二）影响酶活性的因素1.温度大多数酶反应的适宜温度为37℃。2.pH酶的活性与反应液的pH有密切的关系。3.抑制剂(1)特异性抑制剂；(2)非异性抑制剂；(3)竞争性抑制剂。4.激活剂16第四节光镜酶组织化学技术三酶组织化学的原理显示酶的组织化学反应主要有以下几种。（一）金属离子沉淀反应（二）偶氮盐偶联反应（三）靛蓝反应（四）四唑反应17第四节光镜酶组织化学技术四酶组织化学技术的染色方法（一）盖玻片染色缸法（二）滴加作用液法（三）漂浮法（四）环、框技术（五）半透膜技术18第四节光镜酶组织化学技术五光镜酶银织化学技术的基本步骤1.石蜡切片脱蜡至水,冷冻切片固定后水洗。2.孵育液孵育。3.洗涤切片。4.金属置换(金属阳离子沉淀法)。5.洗涤切片。6.显色。7.洗涤、封固光镜观察。19第四节光镜酶组织化学技术六、常用酶组织化学技术（一）碱性磷酸酶的显示方法1.Gomori-Takamatsu钙钴法2.Gomori改良钙钴法3.Lojda改良Burstone偶联偶氮法20第四节光镜酶组织化学技术六、常用酶组织化学技术(二)酸性磷酸酶的显示1.Hoht与Bitensky改良硝酸铅法2.Leder-Stutt改良酚AS-TR磷酸脂法21第四节光镜酶组织化学技术六、常用酶组织化学技术(三)葡糖-6-磷酸酶(G-6-P)的显示l.Chiquoine硫化铅法2.Wachstein-Meisel硝酸铅法22第四节光镜酶组织化学技术六、常用酶组织化学技术(四)Υ-谷氨酰转肽酶的显示原理：以Υ-L-谷氨酰-α-萘胺为底物,生成的萘胺与重氮盐结合形成不溶的偶氮染料。[结果]酶活性处呈橘红色，胞核呈蓝色。23第四节光镜酶组织化学技术六、常用酶组织化学