检验仪器分析技术 课件 第九章临床分子生物学检验仪器

第九章临床分子生物学检验仪器第一节PCR扩增仪目录第九章临床分子生物学检验仪器第二节生物芯片第三节蛋白质测序仪第四节全自动DNA测序仪1.掌握PCR扩增仪、蛋白质测序仪、全自动DNA测序仪及生物芯片的工作原理。2.熟悉PCR扩增仪、蛋白质测序仪、全自动DNA测序仪及生物芯片的基本结构、使用、维护与常见故障处理。3.了解PCR扩增仪、蛋白质测序仪、全自动DNA测序仪及生物芯片的临床应用。学习目标第九章临床分子生物学检验仪器第一节PCR扩增仪第九章临床分子生物学检验仪器PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。PCR定义聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR。第一节PCR扩增仪PCR技术原理一、PCR扩增仪的工作原理PCR技术原理第一节PCR扩增仪一、PCR扩增仪的工作原理PCR反应过程第一节PCR扩增仪PCR技术原理一、PCR扩增仪的工作原理PCR反应过程第一节PCR扩增仪PCR技术原理一、PCR扩增仪的工作原理30次循环后靶序列扩增的数量循环数扩增产物量（2n）1 21＝22 22＝43 23＝84 24＝165 25＝326 26＝6420 220＝1,048,57630 230＝1,073,741,824第一节PCR扩增仪PCR技术原理一、PCR扩增仪的工作原理1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍第一节PCR扩增仪一、PCR扩增仪的工作原理第一节PCR扩增仪二、PCR扩增仪的分类按温控方式水浴式PCR仪变温金属块式PCR仪变温气流式PCR第一节PCR扩增仪二、PCR扩增仪的分类水浴式PCR仪由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成变温金属块式PCR仪中心是由铝块或不锈钢制成的热槽，上有不同数目甚至不同规格的凹孔，用来放置样品管变温气流式PCR仪由机壳、热源、冷空气泵、控制器及辅助元件等组成第一节PCR扩增仪二、PCR扩增仪的分类原位PCR仪由普通PCR仪衍生出的带原位扩增功能的基因扩增仪其样品基座上有若干平行的铝槽，每条铝槽内可垂直放一张载玻片，每张载玻片面均与铝槽紧密接触，控温很精确配有支持原位PCR模块的PCR仪可以一机两用，比较经济SmartCyclerⅡ荧光定量PCR仪

第一节PCR扩增仪三、PCR扩增仪的基本结构第一节PCR扩增仪三、PCR扩增仪的基本结构基本结构荧光检测系统激发光源检测器扩增系统实时荧光定量PCR仪的基本结构16荧光检测系统

激发光源

检测器

发光二极管

卤钨灯光源

超低温CCD

光电倍增管实时荧光定量PCR仪的荧光检测系统第一节PCR扩增仪三、PCR扩增仪的基本结构ABI7500荧光定量PCR仪MJ公司Chromo4荧光定量PCR仪Bio-rad公司iCycler荧光定量PCR仪

第一节PCR扩增仪三、PCR扩增仪的基本结构Rotor-Gene3000荧光定量PCR仪LightCycleTM荧光定量PCR仪第一节PCR扩增仪三、PCR扩增仪的基本结构实时荧光定量PCR仪

金属板式实时定量PCR仪离心式实时定量PCR仪

各孔独立控温的定量PCR仪

第一节PCR扩增仪三、PCR扩增仪的基本结构可作为普通PCR仪使用可带梯度功能可容纳的样本量大，无需特殊耗材温度均一性欠佳，有边缘效应温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线反应条件难以做到与样品完全一致第一节PCR扩增仪三、PCR扩增仪的基本结构金属板式实时定量PCR仪

离心式实时定量PCR仪

温度均一性较好使用的是同一个激发光源和检测器可容纳样品量少有的需用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能第一节PCR扩增仪三、PCR扩增仪的基本结构LightCycleTM荧光定量PCR仪结构示意图第一节PCR扩增仪三、PCR扩增仪的基本结构各孔独立控温定量PCR仪不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块各孔独立控温，适合多指标快速检测软件允许一台仪器同时操作六个样品模块上样不如传统方法方便，而且需要独特的扁平反应管，使用成本较高第一节PCR扩增仪三、PCR扩增仪的基本结构普通PCR仪使用方法开机：打开电源开关，仪器自检放入样本管，关紧盖子设置运行程序（主要是时间、温度等参数）等或调出储存的程序运行即可在仪器使用完后，我们通常先关闭软件，再关闭PCR仪，最后关闭电脑（一）PCR扩增仪的使用方法第一节PCR扩增仪四、PCR扩增仪的使用、维护与常见故障处理

设置一个PCR体系则一般分为8步：

①

预变性：可用94～95℃，2～10分钟,一般用5分钟。

②

变性：一般用94℃，30秒~2分钟,一般45秒~1分钟。

③

退火：温度自定，30秒~2分钟。

（一）PCR扩增仪的使用方法第一节PCR扩增仪四、PCR扩增仪的使用、维护与常见故障处理

④

延伸：70～75℃，一般72℃。

⑤

循环数：一般25～35个循环。

⑥

最终延伸：72℃，5～15分钟。

⑦

保存：10℃，时间设为0。

⑧

结束，关机。

定量PCR扩增仪的操作和普通PCR仪基本相同。第一节PCR扩增仪（一）PCR扩增仪的使用方法四、PCR扩增仪的使用、维护与常见故障处理

1.注意本机的使用环境条件和电源；

2.机盖开关要轻，以防损坏盖锁；

3.严禁工作时打开机盖；

4.定期用中性肥皂水清洗样品槽，严禁使用强碱、有机溶液和高浓度酒精擦洗；

5.有故障时请有专业知识的维修人员或厂家技术人员维修。第一节PCR扩增仪（二）仪器的维护保养四、PCR扩增仪的使用、维护与常见故障处理①

荧光染料污染样品孔；②

PCR管融化，原因可能是温度传感器出问题或是热盖出问题；③

个别孔扩增效率差异很大，可能的原因是半导体模块出现坏点；④

荧光强度减弱或不稳定，产生的原因有滤光片发霉或有水汽，或光源损耗（以卤钨灯为光源的），需更换光源；或需调节检测元件灵敏度；⑤

仪器工作时出现噪音。以上故障部分可自行检查，部分需工程师检修。第一节PCR扩增仪（三）仪器的常见故障处理四、PCR扩增仪的使用、维护与常见故障处理第九章

临床分子生物学检验仪器第二节生物芯片生物芯片,又称微阵列。生物芯片技术是20世纪90年代初期随着人类基因组研究的深入应运而生的一种分子生物学技术，其起源于DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的产物，因具有芯片相似的微型化和大规模分析、高通量处理生物信息的特点而具有广泛的应用前景。生物芯片技术在核酸测序、基因诊断、基因表达差异分析、基因突变检测、基因多态性分析、外源微生物感染鉴定以及临床药物筛选等方面得到广泛应用。一、生物芯片的工作原理及分类生物芯片技术是根据生物分子间特异性相互作用的原理，将生化分析过程集成于芯片表面，设计其中一方为探针，并固定于微小的载体表面，通过分子间的特异性反应，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。根据不同的分类标准，生物芯片可以分为不同的类型分类依据生物芯片的类型基片上交联固定的识别分子种类不同基因芯片、蛋白质芯片、肽芯片、细胞芯片、组织芯片及寡核苷酸芯片等表面化学修饰物的不同多聚赖氨酸修饰芯片、氨基修饰芯片、醛基修饰芯片固相支持物的不同无机芯片和有机芯片结构特征分析过程不同微阵列芯片（以亲和结合技术为核心）和微流控芯片（以微管网络为结构特征）生物化学反应过程不同样品制备芯片、生化反应芯片和检测芯片用途不同分析芯片、检测芯片和诊断芯片功能不同测序芯片、基因作图芯片、基因表达谱芯片、突变检测芯片、多态性分析芯片等二、生物芯片的基本组成生物芯片实质上是一种微型化的生化分析仪器，主要由芯片制备系统、样品制备系统、芯片点样系统、杂交反应系统、信号检测系统和数据分析等系统等几部分组成。二、生物芯片的基本组成（一）芯片制备系统目前制备芯片采用表面化学方法或组合化学的方法来处理固相基质（玻璃片或硅片），然后使用DNA片段或蛋白质分子按特定顺序排列在芯片片基上，芯片制备及其质量在生物芯片分析系统中起着决定性的作用。二、生物芯片的基本组成（二）样品制备系统生物样品的制备和处理是基因芯片技术的第二个重要环节。样品的纯度和杂交特异性直接决定芯片的质量和可信度。因此，将样品进行特定的生物处理，获取其中的蛋白质或DNA、RNA等信息分子并加以标记（为了获得杂交信号），以提高检测的灵敏度。标记的方法有荧光标记法、生物素标记法、放射性核素标记法等。目前采用的主要是荧光标记法，常使用的荧光物质有：荧光素、罗丹明、HEX、TMR、FAM、Cy3、Cy5等。二、生物芯片的基本组成（三）芯片点样系统点样法是将预先通过液相化学大量合成好的探针，或PCR技术扩增cDNA或基因组DNA经纯化和定量分析后，通过由阵列复制器或阵列点样机及电脑控制的机器人，准确、快速的将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。二、生物芯片的基本组成芯片点样仪工作时环境必须保持洁净，避免点样时受到尘土等污染、相对湿度保持在45%～55%之间，以维持点样系统的最佳状态。为了保证样点得到有效的质量检测，一般在点样仪内置样点质量控制装置，可以定量的测定每个样点的大小和体积，从根本上减少漏点现象，并且可以重新补充漏掉的样品点。二、生物芯片的基本组成（四）杂交反应系统杂交反应要根据探针的类型、长度和研究目的来选择合适的杂交条件，减少生物分子之间的错配比率，从而获得最能反映生物本质的信号，是芯片检测的关键。杂交反应是一个复杂的过程，受很多因素的影响，如探针密度和浓度、探针与芯片之间连接臂的长度及种类、杂交序列长度、GC含量和核酸二级结构等。二、生物芯片的基本组成（五）信号检测系统目前最常用的芯片信号检测方法是将芯片置入芯片扫描仪中，通过采集各种反应点的荧光强度和荧光位置，经相关软件分析图像，即可获得有关生物信息。芯片扫描仪是芯片信号检测的扫读装置，是对生物芯片进行信号收集的关键。信号检测系统必须具有高度敏感性，并能有效分辨噪声信号。二、生物芯片的基本组成（六）数据分析系统数据分析系统包括芯片图像识别、数据提取、数据入库、标准化处理和生物学分析等环节。一个完整的生物芯片配套软件应包括生物芯片扫描仪的硬件控制软件、生物芯片的图像处理软件、数据提取或统计分析软件，芯片表达基因的国际互联网上检索和表达基因数据库分析及积累。对所读取的数据处理方面，应用最广泛的是聚类分析，此外，还有主成分分析、时间序列分析等。三、生物芯片的使用与维护（一）生物芯片的使用三、生物芯片的使用与维护（二）生物芯片的维护生物芯片各个分析系统必须要加强日常维护才能使仪器长久保持良好的工作状态，才能使检测结果准确可靠。①正确操作：操作人员应熟悉各系统的性能特点，严格按照操作规程正确操作，应避免仪器在正常工作时出现断气、断电、断水等情况，确保系统的正常运行；②工作环境：清洁卫生，防尘、防晒、防潮湿。温度一般为5～35℃，温度控制精度为±0.1℃，相对湿度应低于80%，海拔高度应低于2000米；③工作电压：波动范围一般不得超过±10%；④运输过程中避免剧烈震动，环境条件不可有剧烈变化；⑤不可将生物芯片滞留于检测器上过长时间。⑥定期检查和维护各个系统并认真做好仪器的工作记录。四、生物芯片的主要临床应用与传统方法相比，生物芯片在疾病检测诊断方面具有独特的优势，特别是对感染性疾病、遗传性疾病和恶性肿瘤等的临床诊断。它可以用一张芯片同时对多个患者进行多种疾病的检测。仅用极小量的样品，在极短时间内，即可为医务人员提供大量的疾病诊断信息。四、生物芯片的主要临床应用1.遗传疾病的诊断

随着人类基因组计划的完成，许多遗传性疾病的相关基因已被定位，为从基因水平上认识遗传疾病并进行早期诊断奠定了基础，如“血友病”、“地中海贫血”、“苯丙酮酸症”、“杜氏肌营养不良症”以及精神性疾病“帕金森氏病”等致病基因已经定位,因此可将对应于突变热点区的寡核苷酸探针合成或点加于DNA芯片上,通过1次杂交完成待检样品多种突变可能性的筛查,实现对多种遗传病的高效快速诊断。四、生物芯片的主要临床应用2.肿瘤疾病诊断

通过基因芯片对各种导致肿瘤产生的基因进行检测，能筛查健康人群中的潜在肿瘤发病基因，以达到早期诊断和预防的目的。例如应用计算机运算法则和DNA芯片技术，尝试了使用DNA芯片确定潜在癌抗原的可能性，研究者采用以计算法则为基础的矩阵来预测人类白细胞抗原(HLA)类配体，并用于人结肠癌的差异表达基因分析，最终识别出一组结肠癌独特的和具有潜在免疫原性的肽。四、生物芯片的主要临床应用3.传染性疾病诊断物

目前许多细菌、病毒等病原体的基因组测序已经完成，将许多代表各种微生物的特殊基因制成一张芯片，经反转录就可检测样品中有无病原体基因的表达及表达水平，由此判断病人是否感染、病原感染进程以及宿主反应。生物芯片检测基因表达差异，较小的细菌基因组可被制成包含该微生物的所有已知序列芯片用以确定被感染个体内所有改变的基因，快速确定毒力基因利用相同的方法，还可在急性感染期和潜伏期研究病毒基因表达。四、生物芯片的主要临床应用同时生物芯片还在疫苗研制、遗传药理学、毒理学和病毒感染的快速诊断、病毒耐药性突变检测、中药安全性的检测、中药材品质的检测、药物基因组学、耐药性分析、个体药物研究等领域也有许多成功应用。生物芯片技术发展至今，已成为一种常规且有效的研究手段，我们期待生物芯片运用其独特的优势特点做出更大的贡献。第九章临床分子生物学检验仪器第三节蛋白质测序仪蛋白质测序是指测定蛋白质分子的氨基酸排列顺序。目前的蛋白质自动测序仪是从肽链的N端开始测序。第三节蛋白质测序仪一、蛋白质测序仪的工作原理

蛋白质测序仪的工作原理：执行全自动Edman化学降解反应和游离氨基酸的分离与鉴定的过程。第三节蛋白质测序仪一、蛋白质测序仪的工作原理1.偶联在弱碱条件下，蛋白质和多肽的自由α-氨基经与异硫氰酸苯酯(PITC)试剂偶联，生成PTC-多肽，与此同时其紧挨的第二个残基的键合力大大减弱，很容易断裂。这一反应在45～48℃进行约15分钟，并用过量的试剂使有机反应完全。

2.环化裂解在无水三氟醋酸（TFA）的作用下，可使靠近PTC基的氨基酸环化，肽链断裂形成噻唑啉酮苯氨（ATZ）衍生物和一个失去末端氨基酸的剩余多肽。紧挨的第二个氨基酸残基暴露出自由的α-氨基，又可与PITC进行偶联反应。

3.转化ATZ-氨基酸不稳定，经25%TFA处理转化为稳定的苯异硫甲脲氨基酸（PTH-氨基酸）第三节蛋白质测序仪一、蛋白质测序仪的工作原理Edman化学降解法原理第三节蛋白质测序仪一、蛋白质测序仪的工作原理4.转化后的PTH氨基酸经自动进样器注入高校液相色谱进行在线检测，根据PTH氨基酸的洗涤滞流时间确定每一种氨基酸类型。第三节蛋白质测序仪一、蛋白质测序仪的工作原理

余下的多肽链的酰胺键不受影响，可以进行下一次降解循环，如此反复循环，可使多肽链N端氨基酸依次逐一降解。每次形成的PTH氨基酸通过蛋白质自动测序仪内的高效薄层层析系统或高效液相层析系统（HPLC）进行实时分离检测，根据PTH氨基酸保留值不同确定各种氨基酸。第三节蛋白质测序仪一、蛋白质测序仪的工作原理Edman化学降解法原理第三节蛋白质测序仪一、蛋白质测序仪的工作原理

将每次断裂下来鉴定的氨基酸依次拼接在一起就可以获得完整的蛋白质一级结构。此法对样品量的要求少，一般只需10~100pmol即可测定氨基酸序列。对于肽链较长的蛋白质，可以先将其切断成多个小肽，对这些小肽进行氨基酸测序，然后进行拼接。第三节蛋白质测序仪一、蛋白质测序仪的工作原理

上述反应大致分为四个步骤，在蛋白质自动测序仪的不同部位进行。偶联反应和环化断裂发生在反应器中，转化在转化器中进行，PTH氨基酸的分析则在检测器。第三节蛋白质测序仪一、蛋白质测序仪的工作原理固定样品偶联反应断裂反应抽提转化反应进样分离、检测数据分析将蛋白质样品通过聚凝胺固定在玻璃纤维板，或者将转印有蛋白质斑点的PVDF膜放置在反应器中。在TMA（R2）溶液中将蛋白质N末端氨基与PITC（R1)反应，生成PTC-蛋白质。使用乙酸乙脂（S2)清洗多余的化学试剂及生成的副产物。以TFA（R3)将PTC-蛋白质N末端結合切断，形成ATZ-氨基酸。使用氯丁烷（S3)将游离的ATZ-氨基酸从转换器中抽提出来。Edman降解反应器使用25%TFA溶液（R4)将ATZ-氨基酸转换成稳定的PTH-氨基酸由乙氰溶液（S4B)溶解的PTH-氨基酸，经进样器注入HPLC。由反向液相色谱系统分离、检测PTH-氨基酸。纪录、显示数据，判定PTH-氨基酸、计算定量、回收率等。转化器进样器HPLC数据处理蛋白质测序分析流程图第三节蛋白质测序仪一、蛋白质测序仪的工作原理

商品化的蛋白质自动测序仪诞生以来，虽然其技术改进不多，但仍是测定蛋白质序列的黄金标准。蛋白质自动测序仪的优势在于已被化学验证的精确性、系统初始投资较小，缺点主要是分析时间过长、测序长度过短（典型的范围为20~50个氨基酸序列）。第三节蛋白质测序仪二、蛋白质测序仪的基本结构基本构件进样器氨基酸分析系统灵敏度信息软件系统反应器第三节蛋白质测序仪二、蛋白质测序仪的基本结构蛋白质自动测序仪结构示意图第三节蛋白质测序仪二、蛋白质测序仪的基本结构反应器进样器进行Edman化学降解反应中偶联反应和环化裂解反应。PTH氨基酸由有机溶剂（如乙腈）溶解后经进样器注入HPLC。第三节蛋白质测序仪二、蛋白质测序仪的基本结构转换器氨基酸分析系统ATZ衍生物在转换器中经有机溶剂（如氯丁烷）抽提出来，再经25%TFA溶液作用转换成稳定的PTH氨基酸。通常由高效液相色谱毛细管色谱柱组成，色谱柱分离是整个测序过程中最关键的一步。各种氨基酸通过这一系统会产生自己的特征吸收峰第三节蛋白质测序仪二、蛋白质测序仪的基本结构信息软件处理系统由计算机主机完成：记录和显示数据，根据氨基酸的色谱峰来判断为何种氨基酸第三节蛋白质测序仪二、蛋白质测序仪的基本结构第三节蛋白质测序仪三、蛋白质测序仪的使用流动相的选择采用与检测器相匹配且粘度小的“HPLC”级溶剂，经过蒸馏和0.45u的过滤去除纤维毛和未溶解的机械颗粒等，经过0.2u的过滤可除去有紫外吸收的杂质对试样有适宜的溶解度水的等级需用纯化水，装水的溶剂瓶要经常更换，连续几天不使用仪器时，要将管路用甲醇清洗脱气除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡成为脱气。脱气可防止由气泡产生而引起的故障；可防止由溶解气体量的变动引起的检测不稳定度分析柱在使用新柱或长时间未用的分析柱之前，最好用强溶剂在低流量下（0.2~0.3ml/min）冲洗30分钟；定期使用强溶剂冲洗柱子；使用缓冲盐后，先用水冲洗4小时左右，再换有机溶剂（如甲醇）冲洗色谱柱和管路；净化样品；分离条件合适；不使用时盖上盖子，避免固定相干枯；使用预柱；避免流动相组成及极性的剧烈变化；避免压力脉冲的剧烈变化。灯管氘灯不能够频繁开启，否则容易损坏第三节蛋白质测序仪三、蛋白质测序仪的维护蛋白质自动测序仪的常见故障及其处理办法故障现象故障原因处理办法管路中不断有气泡生成吸滤头堵塞用5%-20%的稀硝酸超声波清洗，再用蒸馏水清洗泵无法洗液或排液，流路不通宝石球粘附于垫片用针筒抽出口单向阀以产生负压，使宝石球与垫片分开拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗系统压力波动大宝石球或塑料片受污导致密封不好拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清洗系统压力波动大或漏液密封圈磨损而导致密封不良更换密封圈第三节蛋白质测序仪三、蛋白质测序仪的常见故障处理蛋白质自动测序仪的常见故障及其处理办法故障现象故障原因处理办法系统压力波动大或压力偏高线路过滤器堵塞5%稀硝酸超声波清洗漏液手动进样阀转子密封损坏更换转子密封载样困难定量环堵塞或进样器污染清洗或更换定量环、进样器系统高压、峰型变差、保留时间变化液相柱污染正相柱用正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇清洗；反相柱用甲醇、乙腈、氯仿、异丙醇、0.05M稀硫酸清洗样品池和参比池能量相差较大检测器样品池污染用针筒注入异丙醇清洗样品池，如污染严重，拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中超声波清洗第三节蛋白质测序仪三、蛋白质测序仪的常见故障处理1.未知蛋白质的鉴定2.基因工程研究3.蛋白质或肽类纯度的鉴定4.蛋白质功能、蛋白质组学研究5.核酸研究6.其他第三节蛋白质测序仪四、蛋白质测序仪的主要应用第四节全自动DNA测序仪第九章临床分子生物学检验仪器DNA测序仪的工作原理基于：（一）

Sanger发明的双脱氧链终止法（二）

Maxam-Gilbert化学降解法第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理（一）双脱氧链末端终止法测序原理利用DNA的体外合成过程－－聚合酶链反应（PCR）DNA聚合酶的催化以目的DNA为模板按照碱基互补配对原则在引物的引导下单核苷酸聚合形成新DNA链第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理（一）双脱氧链末端终止法测序原理普通的PCR反应体系中，加入的核苷酸单体为4种2’-脱氧核苷三磷酸（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）dNTP结构示意图第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理（一）双脱氧链末端终止法测序原理测序反应体系中，加入的核苷酸单体为2’,3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）ddNTP结构示意图第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理ATemplatePrimerdNTPsPolymeraseTerminatorGCT（一）双脱氧链末端终止法测序原理双脱氧链末端终止法测序反应原理（1）第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理TCGACGTCGACGTCGACGTTAAACTGGCCTAATCGAGTCAGTTGACCGGATTT双脱氧链末端终止法测序反应原理（2）第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理T双脱氧链末端终止法测序反应原理（3）第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理ACG双脱氧链末端终止法测序反应原理（4）由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对长度不等的新生链进行分离，根据片段大小直接读出新生DNA链序列。（一）双脱氧链末端终止法测序原理第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理（二）荧光标记DNA的检测原理测序反应一般以单引物进行DNA聚合酶延伸反应，绝多数产物均为单链。反应结束后，样品经简单纯化处理就可以放置到自动测序仪中开始电泳。两极间极高的电势差推动着各个荧光DNA片段在凝胶分子聚合物中从负极向正级泳动并达到相互分离，且依次通过检测窗口。第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理（二）荧光标记DNA的检测原理由激光器发出的极细光束，通过精密的光学系统被向检测区，在这里激光束以与凝胶垂直的角度激发荧光DNA段，DNA片段上的荧光发色基团吸收了激光束提供的能量而发射出特征波长的荧光。第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理（二）荧光标记DNA的检测原理代表不同碱基信息的不同颜色荧光经过光栅分光后再投射到CCD摄像机上同步成像。收集的荧光信号再传输给计算机加以处理。经测序分析软件对这些原始数据进行分析，最后的测序结果以一种清晰直观的图形显示出来。第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理单色荧光标记法多色荧光标记法荧光标记引物法荧光标记终止底物法荧光标记引物法荧光标记终止底物法（二）荧光标记DNA的检测原理荧光标记DNA的检测原理第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理定义将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5’端，一组（4种）荧光标记引物，其序列相同，但标记的荧光染料颜色不同。（1）多色荧光标记法

--荧光标记引物法第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理反映过程测序反应中，模板、反应底物、DNA聚合酶及标记引物等按A、T、C、G编号被置于4支微量离心管中。

A、T、C、G四个测序反应分管进行，上样时合并在一个泳道内电泳。特定颜色荧光标记的引物则与特定的双脱氧核苷酸底物保持对应关系。（1）多色荧光标记法

--荧光标记引物法第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理定义将荧光染料标记在作为终止底物的双脱氧单核苷酸上。（2）多色荧光标记法

--荧光标记终止底物法第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理反映过程反应中将4种ddNTP分别用4种不同的荧光染料标记。带有荧光基团的ddNTP在掺入DNA片段导致链延伸终止的同时，也使该片段端标上了一种特定的荧光染料。经电泳后将各个荧光谱带分开，根据荧光颜色的不同来判断所代表的不同碱基信息。（2）多色荧光标记法

--荧光标记终止底物法第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理AGCTGGTTAAC模板：TCCATGAT产物：AAGAGGAGGTAGGTAAGGTACAGGTACT（2）多色荧光标记法

--荧光标记终止底物法第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理定义将荧光染料预先标记在测序反应所用引物的5’端，一组（4种）荧光标记引物，其序列相同，标记的荧光染料是一种。（3）单色荧光标记法方法分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法。第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理反映过程将A、C、G、T四个反应分别在不同扩增管中进行。电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳。（3）单色荧光标记法第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理单色荧光标记法与多色荧光标记法的不同点：

1.单色荧光标记法需将A、C、G、T四个反应分别在同扩增管中进行，电泳时各管产物也分别在不同泳道中电泳。

2.多色荧光标记引物法需将A、C、G、T四个反应分在不同扩增管中进行，电泳时可合并在同一泳道中电泳。

3.多色荧光标记终止底物法可将A、C、G、T四个反在同一扩增管中进行，电泳时在同一泳道中电泳。第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理测序分析凝胶中DNA移动方向样品槽激光器输入光学系统成象透镜聚焦透镜高灵敏度相机旋光镜/棱镜组件第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理测序结果第四节全自动DNA测序仪一、全自动DNA测序仪的工作原理全自动DNA测序仪

平板型电泳毛细管电泳第四节全自动DNA测序仪二、全自动DNA测序仪的基本结构平板式电泳毛细管电泳凝胶灌制在两块玻璃板中间，聚合后厚度一般小于0.4mm或更少，又称超薄片层凝胶电泳。将凝胶高分子聚合物灌制于毛细管中（内径50

m～100

m），在高压及较低浓度胶的条件下实现DNA片段的快速分离。第四节全自动DNA测序仪二、全自动DNA测序仪的基本结构基本结构主机应用软件微型计算机第四节全自动DNA测序仪二、全自动DNA测序仪的基本结构结构结构功能区电泳系统、激光器和荧光检测系统自动进样器区、电泳分离块区、检测区（一）主机第四节全自动DNA测序仪二、全自动DNA测序仪的基本结构自动进样器区检测区

凝胶块区

第四节全自动DNA测序仪二、全自动DNA测序仪的基本结构CEQ8000DNA测序仪结构示意图

第四节全自动DNA测序仪二、全自动DNA测序仪的基本结构ABI3730XL型全自动DNA测序仪结构第四节全自动DNA测序仪二、全自动DNA测序仪的基本结构应用软件包括数据收集软件、DNA序列分析软件及DNA片段大小和定量分析软件。（二）应用软件第四节全自动DNA测序仪二、全自动DNA测序仪的基本结构计算机控制主机运行，对来自主机的数据进行收集和分析。设置测序条件（样品进样量、电泳的温度、时间、电压等），同步监测电泳情况并进行数据分析。（三）计算机第四节全自动DNA测序仪二、全自动DNA测序仪的基本结构第四节全自动DNA测序仪二、全自动DNA测序仪的基本结构部分全自动DNA测序仪:第四节全自动DNA测序仪二、全自动DNA测序仪的基本结构第四节全自动DNA测序仪二、全自动DNA测序仪的基本结构（一）毛细管电泳型DNA

测序仪常见故障

电泳时仪器显示无电流电极弯曲电泳时产生电弧其它第四节全自动DNA测序仪三、全自动DNA测序仪的维护与常见故障处理1.电泳时仪器显示无电流电泳缓冲液蒸发使液面降低，而未能接触到毛细管电极弯曲而无法浸入缓冲液中毛细管未浸入缓冲液中毛细管内有气泡等

第四节全自动DNA测序仪三、全自动DNA测序仪的维护与常见故障处理2.电极弯曲安装、调整或清洗电极后未进行电极定标操作就直接执行电泳命令，电极不能准确插入各管中运行前未将样品盘归位、或虽然执行了归位操作，但X/Y轴归位尚未结束就运行Z轴归位等第四节全自动DNA测序仪三、全自动DNA测序仪的维护与常见故障处理3.电泳时产生电弧主要原因是电极、加热板或自动进样器上有灰尘沉积其它测序结束后应将毛细管负极端浸在蒸馏水中，避免凝胶干燥而阻塞毛细管定期清洗泵块定期更换电极缓冲液、洗涤液和废液管

第四节全自动DNA测序仪三、全自动DNA测序仪的维护与常见故障处理（二）平板电泳型DNA

测序仪常见故障电泳时仪器显示无电流