基因工程教案

基因工程教案

第一章基因工程的主要技术

【教学目的】

让学生掌握基因工程操作中常用的技术，包括常规技术生成原理，技术的应用范

围，技术的缺点等。使学生对基因工程的常规操作技术能够了解并且学会应用这

些技术设计、分析实验过程。

【教学重点】

分子杂交技术，PCR技术，DNA测序技术等等。

【教学难点】

Southernblot,PCR,DNA测序技术等等。

【教学方法】

多媒体演示与讲解，启发学生讨论相结合。

【教学过程与教学内容】：

第一节DNA提取与纯化

由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的

提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。

一、质粒DNA的提取

1.碱抽提法提取质粒DNA的原理

强碱使DNA变性，在复性的时候环状的质粒分子两条单链没离开，分子小，所以

复性快，而细菌染色体线性DXA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，

与蛋白质一SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。

1.碱抽提法提取质粒DNA

（2）所用的试剂作用如下：

①溶菌酶：能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1,4糖昔键。

在碱性条件（pH>8）下有活性。

②葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用

而降解。使悬浮后的大肠杆菌不会沉到管底部

③EDTA:Mg2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被晦降解。

@NaOH-SDS:NaOH：使细胞膜结构变形，溶解细胞膜。使DNA双链变性。SDS:与

蛋白质结合成〃蛋白一SDS〃复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。

⑤KAc-HAc缓冲液

溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS,由于基因组DNA很长，

容易被PDS共沉淀。pH4.8醋酸用来中和NaOH变性液，使DNA复性，以免长时

间的碱性条件使DNA断裂。

⑥乙醇

DNA分子以水合状态〃溶于〃水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。用于沉淀DNA。

⑦RNaseA

提取后的DNA中含有小分子的RNA,降解RNA渣滓。

⑧TE缓冲液

DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓

冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。

（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤

第一步：溶菌

使用〃溶液I〃溶解细菌细胞壁。

50mM葡萄糖，

25mMTris-HCl（PH8.0）,

10mMEDTA,

4-5mg/ml溶菌酶，

RNaseA

第二步：破膜，蛋白质和DNA变性

溶液口破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。0.2NNa0H,1.0%SDS

第三步：中和

溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。3M醋

酸钾（用冰醋酸调pH至4.8）

第四步：离心除去沉淀

第五步：纯化DNA

上清液过柱或酚-氯仿抽提。

第六步：沉淀DNA

0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。

2.影响质粒DNA产量的因素

菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数。

（1）受体菌株

一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5、川109、XLl-Blue

等。endA基因编码核酸内切酶I,在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的

寡核甘酸片断。

（2）质粒拷贝数

二、基因组或其他DNA的提取

1.细菌基因组DNA的制备

2.哺乳动物细胞基因组DNA的抽提

3.从植物组织中制备DNA

三、DNA的定量和纯度测定

1.紫外光谱法

DNA（或RNA）在260rlm波长处有特异的紫外吸收峰。用微量比色杯（101）

在紫外分光光度计直接测定。

四、DNA分子量的估计

DNAladder

第二节凝胶电泳技术

一、琼脂糖凝胶电泳的原理

在电场的作用下，DNA分子在琼脂糖凝胶中移动时，有电荷效应和分子筛效应。

前者由DNA

分子所带电荷量的多少而定，后者则主要与DNA分子的大小与构型有关。DNA分

子在带负电荷的缓冲液中向正极移动。在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与其

分子量的对数值成反比关系，大分子量的DNA在电用时比小分子的DNA移动慢，

这样可将不同大小的DNA分开。如将己知含有不同大小DNA片段的标准样品作电

泳对照，那么可以在电泳后估计或计算出待测样品的分子质量。

二、琼脂糖凝胶电泳

1.琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖在

水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“陈〃。琼

脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。浓度高空隙小.

3.琼脂糖凝胶的分辨力

空隙大小决定其分辨分子大小的能力。空隙小，分辨率高：小分子较易通过，

而大分子难通过；空隙大，分辨率低：大小分子几乎以同等速率通过。

DNA分子大小（0.1-60KB）

琼脂糖凝胶的浓度

电泳缓冲液

电压

电泳时间

三、聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合

成凝胶，控

制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。区分范围:0.001

—lkb之间。

聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel,型号从P-2至P-300共10种

聚丙烯酰胺凝胶的应用：

SSCP,SNP,DNA测序,蛋白质分离.

四、凝胶染色

EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。EB在300nm紫外光

照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与DNA

含量及大小成正比。

DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳用硝酸银染色。硝酸银中的银离子被DNA分子吸附在

表面，成为一种复合物，银离子经还原成为银颗粒而显现出褐色的条纹。AgN03

染色，NaOH和甲醛显色。最后Na2c03终止显色。

第三节核酸杂交技术

分子杂交技术，它主要是根据两条单链DNA（或DNA与RNA）中互补碱基序列能

专一配对的原理进行的。在一定条件下，单链DNA或RNA能与另一条单链DNA

上互补的碱基形成氢键，从而使两条单链杂交形成双链DNA分子。通常利用己标

记的某一DNA或RNA片段或合成一段寡核甘酸作为探针，探测重组DNA分子中是

否有DNA片段与探针发生同源性杂交，然后利用放射自显影方法进行检测。

一、探针的准备

（一）探针类型

基因组DNA或RNA

人类染色体DNA片段，或外源DNA片段

体外转录的cRNA或cDNA

mRNA

（-）探针标记

同位素标记

非放射性标记

直接标记：酶，荧光素直接与探针相连

间接标记：探针接抗原，检测物接抗体

（三）探针标记方法

缺口转译法

寡核甘酸标记法

末端标记法

PCR法

（四）探针必须满足的条件

单链结构（双链DNA可用碱变性）足够长度（至少12个碱基）内

部不含互补区

二、Southern杂交

Southern印迹转移试验（Southernblot）又称凝胶电泳压臼杂交技术，是

Southern于1975

年建立的一种DNA转移方法。该法利用硝酸纤维素膜或经特殊处理的滤纸或尼龙

膜具有吸附DNA的功能，先作DNA片段的凝胶电泳，并将凝胶电泳中的DNA区带

吸附到膜上，然后直接在膜上进行同位素标记核酸探针与被测样品之间的杂交，

再通过放射自显影对杂交结果进行检测。

Southernblot不仅可以定位地确定DNA中的特异序列，而且还可根据DNA片段

在凝胶中的泳动距离，确定特异DNA片段分子量的大小及其含量。在进行

Southernblot时，先以限制性内切酶消化待检的DNA片段，然后进行琼脂糖凝

胶电

泳。电泳完毕后，将凝胶放入碱性溶液中，使DNA双链变性，解离为两条单链。

再在凝胶上贴盖硝酸纤维素膜，使凝胶上的单链DNA区带按原来的位置吸印到膜

上。再将此膜置于含有同位素标记的核酸探针的杂交液中感作反应。按照碱基配

对原理，如果被检DNA片段与核酸探针具有互补序列，就能在被检DNA的区带部

位结合成双链的杂交分子，再通过放射自显影显示出来。

DNA杂交的流程：

1DNA电泳

2转膜,转膜时要凝胶底面朝上，上盖硝酸纤维素膜

3探针与膜变性

4预杂交

5杂交

6洗膜

7放射自显影检测

三、Northern杂交

Northern吸印杂交试验（Northernblot）又称为RNA印迹法，是对应于Southern

blot而

命名的。它的特点是电泳结果为RNA图谱而不是DNA图谱，即是将RNA样品通过

琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到硝酸纤维素滤膜上，用同位素或生物素标

记的DNA或RNA特异探制针对固定于膜」.的mRNA进行杂交，洗脱除去非特异

性杂交信号，对杂交信号进行分析，以确定目的基因的表达组织。操作方法大体

上是，先提取总RNA或mRNA,在强变性剂如甲基汞或甲醛存在条件下（防止RNA

形成二级结构环），进行琼脂糖凝胶电泳。电泳后，将胶上分离开的RNA吸印到

化学处理过的纸或硝酸纤维膜上，用同位素标记的探针进行杂交，然后作放射自

显影，这样可以在分子大小上将mRNA与相应克隆的cDNA进行比较。Northern

印迹转移的结果一方面可以用于确定克隆的cDNA是否达到mRNA的全长，另一方

面可以确定外源基因或内源基因在不同组织或不同发育时期的表达情况。

四、菌落（嗜菌斑）原位杂交

噬菌斑杂交法的基本步骤是将重组噬菌体感染的宿主菌倒在平皿上，待生成噬菌

斑后，将

与培养皿一样大小的硝酸纤维素薄膜盖在上面，每个噬菌斑中约105个噬菌体就

影印转移到膜上。膜揭下后，用碱处理除去蛋白质外壳，使噬菌体DNA变性并

同膜共价结合，然后用同位素标记的探针与之杂交，放射自显影检测。按照膜与

培养基上预先做好的方法标记，将阳性噬菌斑挑出来扩增。

五、Western杂交

Westernblot是指经过SDS分离（聚丙烯酰胺凝胶电泳）的蛋白质样品，

转移到固

相载体（如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保

持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为

抗原与对应的抗体起免疫反应，再与醉或同位素标记的第二抗体起反应，经过底

物显色或放射自显影以检查电泳分离的特异性的目的基因的表达的蛋白成分。

Westernblot的操作流程通常是：首先进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，

用考马斯亮

蓝染色，检查蛋白质分离的效果；然后在电场作用下进行电转膜，把胶上的蛋白

质转移到硝酸纤维素膜上；纤维素膜用10%小牛血清BSA封闭30分钟，以封闭

未吸附蛋白质的部位，再将纤维素膜与第一抗体温育，冲洗后再封闭；接着与酶

标第二抗体温育，最后加入酶促底物显色。

第四节PCR技术

一、PCR技术的基本成分

1模板DNA

2一对引物

3dNTPs

4TaqB

5缓冲液

6Mg2+

7超纯水

二、PCR技术的原理和过程

PCR叫多聚酶链式反应，是利用碱基互补配对的原则，在体外快速扩增DNA的一

种方法。首先，分别在待复制的已知序列DNA分子两端各设计一条引物，其中在

DNA5'端的引物(P1)对应于」.链DNA单链的序列，3'端的引物(P2)对应于下链

DNA单链的序列，P1和P2按5'-3'方向相向配置。然后在含有引物、DNA合成底

物dNTPs(dATP、dCTP、dGTP、dTTP4种脱氧核糖核甘酸等摩尔数混合物)的缓

冲液中，通过高温变性，使双链DNA变成单链DNA模板，降低温度复性，使引物

与模板DNA配对，利用耐热的DNA聚合酶便可以合成产物DNA。若引物和dNTPs

过量，则在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使

产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的

模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按2n方式扩增。

三、PCR反应程序：

1=94°

C2min

2=94°

C30sec

3=55-65°

C30sec

4=72°CImin

5=Goto2,30

cycles

6=72°

C5-10min

Holdat4°C

四、提局PCR特异性反应的因素：

1特异性模板

2高退火温度

3较低浓度引物、酶和Mg2+

4较少的循环数

5较纯的模板与引物(无蛋白酶、DNA酶与EDTA污染)

五、PCR技术的扩展：

1巢式PCR：设计内外两对引物同时扩增目的基因片断，提高反应的特

异性。

2不对称PCR(asymmetricPCR)：不对称扩增，两条引物浓度50T00：

1，所以主要扩增一条链。

3反向PCR(inversePCR)：扩增已知序列两侧的未知序列。

4多重PCR(multiplexPCR)：同时设计几对引物扩增同一条DNA链

5逆转录PCR（retrotranscriptionPCR：RT-PCR）：以RNA为模板的

PCR

6荧光定量PCR：通过荧光染料或荧光标记的特异性探制，对PCR产物

进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析。

六、荧光定量PCR：

通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监

控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析。

标记方法：

1.内插染料（SYBRgreenI）

2.双标记探针（5端标记荧光分子，3端标记吸收或淬灭荧光的分子）

3.分子信标：同上，双标记，自身环化时检测不到荧光，线性时荧光逐渐加强

荧光定量PCR实时定量分析的优点：

①全封闭的PCR过程，无需跑胶，无需后处理；

②采用dUTP-UNG酶放污染，有效降低污染机会；

③实时在线监控，对样品扩增的整个过程进行实时监控，实时观察产物的增加，

直观看到反应的对数期；

④降低反应的非特异性，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了

PCR反应的特异性；

⑤增加定量的精确性，在样品扩增反应的最佳时段（对数期）进行数据采集，不

是传统的终点法；

⑥线性关聚.接.到达阈值的循环数和样品的起始模板浓度之间具有线性关系；

⑦结果分析更加快捷方便。

第五节DNA序列分析

一、Sanger双脱氧链终止法

原理：双脱氧核糖核甘三磷酸（ddNTP）不会与正常的脱氧核糖核昔三磷酸（dNTP）

形成磷酸二酯键，从而链的随机终止；建立4个系统，就可得到4个套组（nested

sets）；在一个胶板上同时电泳，就可读出模板链的互补链的顺序。

特性：利用DNA聚合酶进行引物延伸反应；其引物是带有放射性标记的，可通过

放射自显影检出；双脱氧核糖核甘三磷酸（ddNTP）作为链终止剂；采用聚丙烯

酰胺区分长度仅差一个碱基的单链DNAo

2.技术要点

（1）制备单链DNA模板

（2）特殊的DNA多聚酶

①不能有5'®3'和3'®5'的外切酶活性；

②与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。

（3）制备2'和3'双脱氧的ddNTP

（3）dNTP/ddNTP=100/1时，DNA电泳带谱的分离效果最好，可读出200

多个核甘酸序列。

制备一小段单链引物（DNA或RNA）需带有放射性或荧光标记。

二、Maxam-Gilbert化学修饰法

1将双链或单链DNA经过不同的化学方法降解，得到随机的短的DNA片段，再通

过电泳分离读取顺序。

2每次只能在一个特定的核甘酸处降解：

G反应：硫酸二甲脂（DMS）使鸟噂吟N7甲基化；

A+G反应：甲酸使喋吟环上的氮质子化导致糖昔键被削弱，进而喋吟

环被喀咤取代；

C+T反应：脏能够裂解喀咤环，进而导致其脱落；

C反应：在一定浓度的条件下，胧只对胞喀咤起作用

三、DNA杂交测序

1原理：

90年代初期由英国、前南斯拉夫利俄罗斯的4个科学家小组同时提出来的。1）

只有完全互补的DNA序列才能杂交形成完全的双链分子。杂交效率最高。（2）

有个别不互补碱基时，杂交效率下降。（3）非互补碱基越多，杂交效率越差。

2.技术要点

（1）DNA芯片（chip）

把寡聚核甘酸探针的3'端或5,端与玻璃或凝胶形成共价连接。目前可以做出

65536种8-mer探针芯片。每种探针的序列和位置己知，可被电脑读出。

四、DNA自动化测序

荧光物质标记。用激光能激发出不同颜色的荧光。Sanger脱氧终止法。激光探

头直接读胶，实时阅读，电脑自动把荧光信号转化成对应的碱基，并打印出DNA

序列。反应可在一个试管中进行

【思考题】

1.Southernblot,Northernblot,Westernblot的区别和联系是什么?

2.荧光定量PCR有哪些应用？

3.巢式PCR有什么优点？

4.基因芯片的应用有哪些？

5.酵母双杂交系统的优缺点如何？

6.构建cDNA文库需要用到哪些工具酶？

第二章基因工程的酶学基础

基因工程的每一个关键步骤都需要特定的酶的参与。基因扩增需要DNA聚合

酶；基因切割需要限制性核酸内切酶；DNA片断的连接需要DNA连接酶；DNA的

末端修饰需要DNA外切酶、多核甘酸激酶、碱性磷酸酶或末端转移酶等等（表

3.1）o本章将简要介绍和讨论一些基因工程操作中常用的酶的性质和用途以及

影响酶活性的条件和因素。

表31重组DNA实验中常用的若干种核酸酶

核酸酶名称主要功能

II型核酸内在特异性的碱基序列部位切割DNA分

切限制酶子

DNA连接将两条DNA分子或片段连接成一个整

酶体

大肠杆菌通过向3,一端逐一增加核甘酸的方

DNA聚合酶式填补双链DNA分子上的单链裂口

I

反转录以RNA分子为模板合成互补的cDNA

酶链

多核甘酸激把一个磷酸分子加到多核甘酸链的

酶5'-0H末端

末端转移酶将同聚物尾巴加到线性双链DNA分子

或单链DNA分子的3,-0H末端

核酸外切酶从一条DNA链的3,一端移去核苜酸残

III基

1核酸外切催化自双链DNA分子的T-端移走单

酶核甘酸，从而暴露出单链3,-端

碱性磷酸酶催化从DNA分子的5'-或3,-端或同

时从5,-和3,一端移去末端磷酸

S1核酸酶催化RNA和单链DNA分子降解成5,-

单核甘酸，同时也可切割双链核酸分

子的单链区

Bal31酸酶具有单链特异的核酸内切酶活性，也

具有双链特异的核酸外切酶活性

TaqDNA聚能在高温（72℃）下以单链DNA为模

合酶板按5'-3,方向合成新生互补链

3.1DNA聚合酶

第二章基因工程的酶学基础

DNA聚合酶（DNAPolymerase）在生物体内以一条DNA链为模板合成另一条互补

DNA链。病毒、噬菌体、细菌以及哺乳动物等不同门类的生物的DNA聚合酶种类

和结构虽然不尽相同，但它们的DNA聚合酶的共同特点是都需要一小段带有3'

-0H的核酸引物（Primer）、4种dNTP、Mg*和单链DNA模板（Template）°基

因工程中常用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenowfragment、T7DNA

聚合酶、T4DNA聚合酶、修饰过的T7DNA聚合酶、耐高温的DNA聚合酶（如Taq

DNA聚合酶）以及逆转录酶等（表3.2）。

表3.2基因工程中常用的DNA聚合酶极其特性比较

聚合

30-5050-30持续

反应

聚合酶的名核酸外核酸外合成

速率

称切酶活切酶活能力

性性

E.coliDNA

低有中速低

聚合酶I

KIenow大片.

低无中速低

段酶

反转录酶无无低速中

T4DNA聚合

高无中速低

酶

.■＞，.

天然的T7高无快速

DNA聚合酶

化学修饰的

T7DNA聚合低无快速高

酶

遗传修饰的

T7DNA聚合无无快速高

酶

TaqDNA爽合

无有快速高

酶

3.1.1大肠杆菌DNA聚合酶I（PolI）

大肠杆菌中有三种不同类型的DNA聚合酶，即DNA聚合酸I、DNA聚合酶1【

和DNA聚合酶III,它们分别简称为PolI、PolII和PolHL其中PolI和Pol

II的主要功能是参与DNA的修复过程，而PolIII的功能是进行DNA复制。在这

三种DNA聚合酶中，PolI在基因工程中最为有用，主要被用来制作核酸杂交用

的DNA探针（Probe）。

3.1.1.1大肠杆菌DNA聚合酶I的性质

大肠杆菌DNA聚合酶1是由大肠杆菌ploA基因编鸟的一种单链多肽蛋白质，

分子量为109义10%@1/0]I酶有三种不同的酶催化活性，即位于N端的5C-3C

的核酸外切酶活性、5c-3,的聚合酶活形和较弱的3c-5,的核酸外切醮活性。

3.1.1.2大肠杆菌DNA聚合酶I的反应条件

大肠杆菌DNA聚合酶I与其它DNA聚合酶一样，也需要DNA模板和带有3,

-0H的引物以及dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）底物。另外还需要Mg工

3.1.1.3用肠杆菌DNA聚合酶I制备探针

大肠杆菌DNA聚合酶I在基因工程中的主要用途是制作核酸杂交用的DNA探

针。探针是指能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，并带有标记的寡聚核

酸分子。标记可以是放射性同位素或非放射性物质，标记可以在探针序列的5,

端或3'端，也可以是在其他区域甚至探针的全长。

利用DNA聚合酶I同时具备5,一3,外切酶活性和5,一3,的聚合酶活性

的特点制备DNA探针的方法称为切口平移法（Nicktranslation）。首先在双链

DNA分子的一条单链上用DNaseI制造一个切口（仅磷酸二脂键被切断），DNA

聚合酶I的5c-3婿亥酸外切酶活性和聚合酶活性就可以同时在这个切口上发生

作用。当外切酶活性从切口的人-侧切去一个5M亥甘酸之后，聚合作用就会在

缺口的3廿侧的-0H上延伸补上一个新的核甘酸。这样5/侧的核甘酸不断地被

移去，3k侧的核甘酸又按顺序增补，于是切口便沿着DNA分子按合成的方向移

动（图3.1）。如果底物dNTPs中的某一种dNTP是带有放射性标记的话（如Q

-32P-dNTP）,新增补上的DNA片断就会带有放射性，可用作探针。

3.1.2Klenow片段

用枯草杆菌蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶【可以切掉其N端的5'—3'外

切醮活性部分（36KDa）,余下的76KDa具有全部的5'-3'聚合酶活性和制

f5c的核酸外切酶活性，这个片段被称为Klenowfragment,又叫做Klenow聚

合酶或Klenow大片段酶。由于丧失了5'-3'外切酶活性，Klenow聚合酶不能

像其母体DNA聚合酶I那样以独特的切口平移方式标记DNA探针。在基因工程操

作中，Klenow聚合酶的主要月途是填补单链缺口、补平双链DNA经限制性内切

酶切割后形成的靠隐蔽末端、标记DNA片段的3'末端以及合成cDNA的第二链

（图3.2）o

图3.2Klenow片段，只填补缺口

多数限制性内切酶切割DNA双链后形成的末端不是齐平末端，而是交错断开

的粘性末端。其中有些是5'瑞隐蔽而3'端突出的，有些是3'端隐蔽而5'端

突出的。对于后一种形式的末端，其隐蔽的3'-0H就能起到引物的作用，在DNA

聚合酶的作用下以突出的5'端单链部分为模板可被延伸直到与5'端齐平，称

为3'补平。在补平的过程中，底物dNTPs中如果有一种或数种的带有放射性或

非放射性标记的脱氧核甘三磷酸（如有一种是在其Q-磷酸基团具有32P标记的

脱氧核昔三磷酸），用Klenow聚合酶延伸其3'隐蔽末端，带有标记的dNTP就

可能被掺入新延伸的单链3'末端中，完成DNA3'末端标记（图3.3）。以mRNA

为模板经逆转录酶合成的单链DNA称为cDNA第一链。然后就可以用Klenow聚合

酶以这条cDNA第一链为模板合成其互补DNA链，即cDNA第二链。

图3.3DNA分子的末端标记

(a)由EcoRI限制酶产生的DNA片段末端用a-32P-dATP标记；

(b)BamHI限制酶产生的DNA片段末端用a-32P-dNTP标记。*

号表示带叩标记的核甘酸

3.1.3T4DNA聚合酶

T4DNA聚合酶是由T4噬菌体基因43编码的，是从"噬菌体感染的大肠杆

菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合醐，具有3c的聚合酶活性和的

核酸外切酶活性。这一点类似大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段，因此T4DNA

聚合酶也可以用来标记DNA隐蔽的30-末端。但像大肠杆菌DNA聚合酶I一样,

T4DNA聚合酶在没有脱氧核昔三磷酸(dNTPs)的条件下，3矽卜切酶活性也能从

3,端降解DNA双链(或单链)，制造出3'隐蔽端。

如果反应混合物中只有一种dNTP,降解到DNA3'端是这种dNTP的位置时就

会停止。当反应物中4中dNTPs都有时T4DNA聚合酶又可以像DNA聚合酶I或

Klenow片段那样执行聚合酶功能，以隐蔽的3,-0H为引物补平3,隐蔽端。因

此T4DNA聚合酶可以进行3,隐蔽末端的补平并同时进行末端标记。在基因操

作中T4DNA聚合酶的独特用途是用来对平端或5'隐蔽端双链DNA进行末端标

记。首先在无dNTPs时利用T4DNA聚合酶的3«f5c外切酶活性作用于平端或5'

隐蔽端双链DNA,制造出3'隐蔽末端。制造出的3'隐蔽末端起引物的作用。

然后再加入含有一种被标记的dNTP(如a-32P-dNTP)的dNTPs。T4DNA聚合

酶的聚合作用又会将它所制造出的3'隐蔽末端补平，反应物中的标记dNTP会

被掺入新补平的末端中，结果看起来似原有的才端被取代为新合成的带有标记

的3'端，因此特称为取代合成法(图3.4)。

3.1.4T7DNA聚合酶

T7DNA聚合酶是从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基

组成：大亚基由T7基因5编码，分子量为84kDa,本身具有DNA聚合酶和单链

的罪―5c外切酶活性。小亚基是一种硫氧还蛋白（thioredoxin）,由大肠杆菌

基因编码，分子量为12kDa,功能是增加大亚基对模板的亲和性。小亚基的存在

使T7DNA聚合酶持续合成DNA的能力非常强，它能够在引物上延伸数千个核首

酸而不发生任何与模板解离现象，同时基本上也不受DNA二级结构的影响。而这

类二维结构则会阻碍大肠杆菌DNA聚合酶、T4DNA聚合酶或反转录酶的活性。

因此T7聚合酶在合成大分子量DNA是很有用。T7聚合酶和T4聚合酶具有大体

相同的冢一5c核酸外切酶活性强度，所以如同T4DNA聚合酶一样，T7DNA聚合

酶也可以通过单纯的延伸或取代合成法标记DNA的3c末端或补平3'隐蔽末端。

3.1.5修饰的T7DNA聚合酶

虽然T7DNA聚合酶具有极强的持续合成大片段DNA的能力，但其罪一5,核

酸外切酶活性也很强。用化学方法或遗传手段对天然的T7DNA聚合酶进行修饰,

使T7噬菌体的基因5蛋白的核酸外切酶区域失活，从而完全丧失3C-5c的核酸

外切酶活性，而聚合能力和速率却进一步增强。在基因操作中，修饰的T7DNA

聚合酶除具有像T4和天然T7DNA聚合酶一样能被用来进行3'隐蔽端补平和末

端标记之外，还能有效催化脱氧核甘酸类似物（如双脱氧甘酸，-代］脱氧核

甘酸及脱氧肌甘核甘酸等）掺入新合成的DNA链中，所以在双脱氧法DNA测序中

有特殊的用途。

3.1.6反转录酶

以RNA为模板合成DNA的DNA聚合酶叫依赖于RNA的DNA聚合酶,也叫做RNA

指导的DNA聚合酶或反转录酶（图3.5）。

图3.5反转录以RNA为模板指导和成DNA

从多种RNA病毒中都能分离出这种酶。目前基因工程中使用最普遍的是来源

于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（Avianmyeloblastosisvirus,AMV）的反转录酶。

它是由65kDa的□链和95kDa的P链组成的。其中a肽链具有反转录酶活性和

RNasell活性。RNasell是由a多肽链经蛋白酶水解切割之后产生的一种多肽片段

（分子量为24kDa）,是一种核糖核酸外切酶，它以5«f3c或3«f5C的方向特

异地降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链。P肽链则具有以RNA-DNA杂交分子为

底物的5c-3c脱氧核酸外切酶活性（图3.6和图3.7）°

图3.6反转录酶5，f3,方向的DNA聚合酶活性

图3.7反转录酶的5C-3C方向和常-5,方向的核糖核酸外切酶活性（RNaseH

活性）

反转录酶在基因工程中最主要的用途是以mRNA为模板合成cDNAo虽然这种

酶同样需要一段引物的存在，但由于真核生物绝大多数的mRNA3'端都有一段

PolyA,因此可以合成一段寡聚T（oligodT）与PolyA退火作为引物合成cDNA

第一链。也可以用随机引物（Randomprimer）合成cDNA第一链。随机引物是随

机顺序形成的寡聚DNA片断，理论上它能与各种序列的模板结合。用碱水解除去

mRNA后，单链cDNA能够自我折叠形成一种发夹环结构（原因未知），它可供作

cDNA第二链合成的引物。用反转录酶或Klenow聚合酶催化第二链cDNA的合成。

用SI核酸酶消化除去单链区的发夹环结构就成了可供PCR扩增的双链DNA模板。

3.1.7耐高温的聚合酶

在体外扩增基因时需要高温变性DNA双链模板，然后用DNA聚合酶进行DNA

合成。合成完毕后还要把新合成的DNA双链再高温变性，如此循环才能扩增出大

量所需要的目的DNA,这就是PCR（聚合酶链式反应）的基本思想。在不断的高

温变性循环中，每次都将会把加入的DNA聚合酶灭活，对酶造成极大的浪费，增

加成本。因此迫切需要一种耐高温的DNA聚合酶。

3.1.7.1TaqDNA聚合酶

TaqDNA聚合酶是从一种水生嗜热真菌（Thermusaquaticus）yTl株分离提

取的热稳定性酶，分子量大约为94kDa,具有5«f3c聚合酶活性和5«f3助卜切

能活性，但没有靠一5c外切醉活性。该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火

山温泉中分离的。这种酶在75〜80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核昔

酸，70℃延伸率大于60个核甘酸/秒，55c时为24个核甘酸/秒。温度过高（90℃

以上）或过低（22℃）都可影响TaqDNA聚合酶的活性。TaqDNA聚合酶虽然

在90c以上几乎无DNA合成，但有良好的热稳定性。PCR反应时变性温度为95℃

Imin,50个循环后，TaqDNA聚合酶仍有65%的活性。TaqDNA聚合酶合成后的

DNA双链不是平端，3,端常常有一个突出的碱基A,便于与k端有一个突出的

T的线性载体（『载体）直接连接，这是它的一大优点。此外TaqDNA聚合酶还

具有逆转录活性，其作用类似逆转录酶。此活性温度一般为65〜68℃,有MrT

存在时，其逆转录活性更高。但TaqDNA聚合酶主要被用在PCR扩增的高温循环

条件中，因为这是普通DNA聚合酶所不能胜任的工作。

3.1.7.2PfuDNA聚合酶

PfuDNA聚合酶也是一种热稳定性酸，分子量为92kDa,是从Pyrococcus

furiosus中分离的。该酶在75℃时可进行DNA复制。与TaqDNA聚合酶不同的

是它除具有5C-3c聚合酶活性和5«f3c外切酶活性外，还具有3C-5c外切酶活

性。PfuDNA聚合酶的3'-5'外切酶（校正）活性可将错配的碱基切除，这是它

优于TaqDNA聚合酶的特点。此酶是目前己发现的所有耐高温的DNA聚合酶中出

错率最低的，因而PfuDNA聚合酶常用于高保真的PCR反应和引物的延伸反应。

但PfuDNA聚合酶产生的PCR产物为平端，无末端磷酸化。

3.2DNA修饰酶

在基因操作中经常涉及到需要对扩增出来的或切割得到的DNA片段的末端进

行必要的修饰以便于连接或进行其他特殊的反应。无论是在3'端添加或降解核

昔酸还是在5,端磷酸化或去磷酸化，都需要特殊的酶催化反应，这些酶被称为

修饰酶。下面简要介绍几种基因工程中常用的DNA修饰酶的特性和用途。

3.2.1末端脱氧核昔酸转移酶

末端脱氧核甘酸转移

酶(Terminaldeoxynucleotidyltransferase)简称DNA末端转移酶(Terminal

transferase),是从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量(34kDa)的碱性蛋白

质，由分子量分别为26kDa和8kDa的大小亚基组成。这种晦具有5,一3CDNA

聚合酶活性，能够催化将脱氧核甘酸分子逐个添加到线性DNA分子的常-0H末

端(图3.8)。但与一般的DNA聚合酶不同，在反应中需要二甲肿酸缓冲液。末

端转移酶的另一个特性是不需要模板。底物可以是单链DNA、也可以是3'-0H

突出的双链DNA、甚至平端双链DNA在Co,-代替Mg’时也可以在3'-0H添加脱氧

核甘酸。由于不需要模板指导，4种dNTPs中的任何一种都可以被添加到3'端。

但当反应混合物中只有一种dNTP时，就可以形成仅由一种核甘酸组成的罪尾巴,

我们特称这种尾巴为同聚物尾巴(Homopolymerictail)o这种方法在基因操作

中称为同聚物加尾。即在需要连接的平端DNA3'末端分别添加上互补的核甘酸

同聚物尾巴（如一条DNA双链3'端添加GGG,另一条添加CCC）,就形成了粘

性末端，便于连接。

末端转移酶的另一个用途是被用来再生限制性内切酶的酶切位点。如Hind

III的酶切位点序列是5'-AAGCTT-3',用Hindlll酶切开载体DNA后成为粘性末

端，再用Klenow片段补平未平端，即成为两头均有5'-AAGCTT-3'末端的开口

载体，然后用末端转移醮催化加上同聚物尾巴。在将要连接的外源DNA片段两头

用末端转移的加上互补同聚物尾巴，与载体连接。结果在外源插入片段的两侧各

有一个HindHI的酶切位点序列5'-AAGCn-3',这样便于用HindHI酶切取下外

源DNA片段（图3.9）。

除了上述用途外，末端转移酶还可以用来对DNA进行3'末端标记。催化带

有放射性标记（如［Q32p］一3«-脱氧核甘酸）或非放射性标方的脱氧核昔酸（如

生物素-11-dUTP,8-（2,4-二硝基苯-2,6-氨基乙基）氨基腺喋吟核昔

-5«一三磷酸［8-（2,4-dinitrophenyl-2,6-aminohexyl）aminoadenosine

-50-triphosphate］，或2c-脱氧尿喀咤核昔-5C-三磷酸-5C-烯酰胺生物

素（2C-deoxyuridine-50-triphosphate-50allylaminobiotin）添力口至3'

末端。

3.2.2T4多核昔酸激酶

T4多核甘酸激酶是由T4噬菌体的pseT基因编码的。可从T4噬菌体感染的

大肠杆菌细胞中分离出来。现在在多种的晡乳动物细胞中也发现了这种激酶。T4

多核甘酸激酶能催化g磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5'-0H端使其

磷酸化，不论其T-0H端突出与否，也不受底物分子链的长短大小限制，即使

是单核甘酸也同样适用。T4多核昔酸激酶的这一功能在基因操作中十分有用，

因为当两个DNA片段连接的时候是3'-0H与5'-P形成磷酸二脂键。5'端非磷

酸化的DNA参与连接时必须先用T4多核甘酸激酶把5'-0H磷酸化。此外当使用

Y标记的ATP作前体物时，多核甘酸激酶可以使底物核酸分子的5C-OH末

端标记上丫一冲，实现末端标记（图3.10）。

图3.10T4多核昔酸激酶的活性与DNA分子"-末端的标记

3.2.3碱性磷酸酶

与T4多核甘酸激酶的作用相反，碱性磷酸酶能够将DNA（或RNA）的5'-P

脱掉，使5,端也变成-0H（图3.11）。我们在基因克隆的时候为防止载体互相

连接，常常先用碱性磷酸酶处理去掉5,-P使之不能与自身的3,-0H连接，但

其3'-OH仍然能与外源DNA插入片段上的5'-P连接上一条链。虽然两条链由

于载体5,端被脱掉P而都不能完全连接，但这仍然能使重组载体保持环形结构,

转入受体菌后未连接的切口会被受体菌修豆。

图3.11碱性磷酸酶将DNA的5,磷酸脱掉

基因操作中常用的碱性磷酸酶有两种来源：一种是从大肠杆菌中纯化出来

的，叫做细菌碱性磷酸酶(Bacterialalkalinephosphatase,BAP),具有抗

热性，不容易用加热的办法灭活溶液中的BAP。另一种是从小牛肠中纯化出来的,

叫做小牛肠碱性磷酸酶(Calfintestinalalkalinephosphatase,简称CIP),

SDS中加热68°C可完全失活，可以被简单地加热失活。而且CIP的比活性要比

BAP的高出10〜20倍。因此，在大多数情况下都优先选用CIP酶。

3.3核酸外切酶

在基因操作中，有时需要从某一个

末端开始沿一个特定的方向将某一段DNA缩短。这就需要用到核酸外切酶。核酸

外切酶(Exonucleases)就是一类从多核甘酸链的一头开始催化降解核甘酸的酶

(图3.12)。按作用的底物特性，可分为单链核酸外切能和双链核酸外切酸。

单链核酸外切酶消化单链核酸，如大肠杆菌核酸外切酶I(exoI)和核酸外切

酶vn(exovn)o双链核酸外切酶，能消化双链核酸，如大肠杆菌核酸外切酶in

(exoIII),X噬菌体核酸外切酶(Xexo)以及T7噬菌体基因6核酸外切酶等。

本节简要介绍这几种核酸外切酶的特性及其在基因操作中的用途。

3.3.1单链DNA外切酶

3.3.1.1大肠杆菌核酸外切酶I

大肠杆菌核酸外切酶I(exoI)识别单链DNA(ssDNA)的5'-0H,然后以

5C-3c的方向逐一切掉核昔酸。

3.3.1.2大肠杆菌核酸外切酶W

大肠杆菌核酸外切iWVn(exoVII)识别单链DNA(ssDNA)的3'-OH或5'

-P,将DNA切成212bp的寡核酸短片段，且不需要Mg"离子。

3.3.2双链DNA外切酶

3.3.2.1大肠杆菌核酸外切酶DI

大肠杆菌核酸外切酶HI(exoIII)识

别双链DNA(dsDNA)的3'-OH,然后以3，一5C的方向逐一切掉DNA链，释放5c

-单核甘酸(图3.13)o此外，核酸外切酶III还具有对AP位点(无喋吟位点及

无喀咤位点)特异的核酸内切酶活性、30-磷酸酶活性和RNaseH酶活性。RNaseH

酶活性，是降解DNA-RNA杂种核酸分子中的RNA链。核酸外切酶HI在基因操作

中的主要用途是通过其3C-5c外切酶活性使双链DNA分子产生出3'端隐蔽的单

链区。这样就能用Klenow酶和放射性标记的核甘酸制备特异的放射性探针。此

外由于核酸外切酶HI是双链特异性的，从双链DNA的两个3'-0H开始以3'一

5'方向降解，在降解至DNA中部后将无双链可降，形成两条DNA单链，可以用

作DNA测序的模板。

3.3.2.21核酸外切酶(入exo)

入核酸外切酶是从感染了入噬菌体的大肠杆菌细胞中纯化出来的。这种酶识

别双链DNA分子的5C-P末端，以解一3c方向逐步水解，释放出屣单核甘酸，

但它不能降解50-0H末端。最终会把双链DNA降解成两条单链。

入核酸外切酶在基因操作中的用途与大肠杆菌核酸外切酶III类似，将双链

DNA转变成单链的DNA,为双脱氧法进行DNA序列分析提供单链模板。另外可制

造5,隐蔽末端从而突出3,-0H端，以便于在只有Mg"存在下用末端转移酶进行

同聚物加尾。

3.3.2.3T7基因6核酸外切酶

T7基因6核酸外切酶是大肠杆菌T7噬菌体基因6编码的产物。这种核酸外

切酶既能识别双链DNA的5'-P又能识别5C-OH,然后以5C-3c方向逐步水解

DNA,释放出5c单核昔酸。因此T7基因6核酸外切酶同入核酸外切酶具有同样

的用途。但它的加工活性要比入核酸外切酶的低。在表3-3中总结了本节中介绍

的核酸外切酶的特点。

表3.3若干种核酸外切酶的基本特性

底物DNA外切酶切割方式识别位点

单链DNA大肠杆菌核酸外切酶I(exoI)50-3050-OH

大肠杆菌核酸外切酶vn50-305，-P

(exoVII)30-503'-0H

双链DNA核酸外切酶III(exoIII)30-503'-0H

入核酸外切酶(入exo)5—35,-P

T7基因6核酸外切酶5"35'-P

50-OH

3.4核酸内切酶

在基因操作中更多的时候是需要从大片段的基因组中或从载体上将我们所

需要的基因片段切割下来。这种切割不是从DNA的某个末端开始，而是在一个大

片段的内部制造一个或多个切口，将目的DNA片段分离出来。这就需要用到另外

一类非常重要的酶，称为核酸内切酶。核酸内切酶按其所作用的底物特点也可以

分为单链核酸内切酶和双链核酸内切酶。本节将主要介绍儿种基因操作中常用的

核酸内切酶。

3.4.1单链DNA内切酶

单链DNA内切酶特异性地识别并从内部切断单链DNAo在基因操作中用途较

大的是S1核酸内切酶和Bal31核酸酶。

3.4.1.1S1核酸内切酶

S1核酸内切酶是从稻谷曲霉（Aspergillusoryzae）中纯化来的，是一种高

度单链特异的核酸内切酶。这种酶的活性要求低Zr?离子浓度和pH4.0~4.3的范

围。当pH值上升到4.9时，降解速率会下降50%。在最适的酶催反应条件下，

降解单链DNA的速率远比降解双链DNA速率快（约75,000倍）。有些阳离子螯

合剂，如EDTA和柠檬酸等，能强烈地抑制S1核酸的活性。此外磷酸缓冲液和

0.6%左右的SDS也能抑制它的活性，但尿素和甲酰胺等试剂则影响很小。

S1核酸内切酶的功能是切割单链RNA和单链DNA分子成为5c单链核甘酸。

另外它也能作用于双链核酸分子中的单链区。如双链DNA中的其中一条链上带有

小缺口或其中一条链上存在由于不能互补配对而凸起的部分，S1核酸内切酶能

从此处切断核酸分子，即使这个单链区小到只有一个碱基对的程度（图3.14）o

但S1核酸内切酶不能降解天然构型的双链DNA和RNA-DNA杂种分子。

（i）对单链DNA的活性，切割单链的（ii）对带有缺口或裂口的双链DNA或

DNARNA的活性

图3.14S1核酸酶的活性

S1核酸内切酶在基因操作中的用途之一是降解由限制性内切酶切割形成3'

或5,端突出的单链部分粘性末端，形成齐平末端。不过这一工作别的核酸酶也

能做到。在合成cDNA第二链时常利用cDNA第一链的3'端弯回来形成的发卡结

构（原因不明）作为引物，S1核酸内切酶独特的用途是在cDNA第二链合成完毕

后将这个突出的单链发卡结构切掉，以得到双链cDNA。

其次由于S1核酸内切酶能识别杂交双链中因碱基不能互补配对而形成的突

出单链环，基因操作中就利用这一特性来定位真核基因的内含子区域。真核生物

基因中含有不编码的内含子区，在转录后的加工过程中被剪切掉，相应的外显子

区的mRNA区拼接成成熟的mRNA。当用mRNA与相应的基因组DNA杂交时，DNA

中的外显子区全部能与mRNA互补配对成双链，而内含子区DNA由于找不到与之

互补配对的mRNA而突出成为单链环。S1核酸内切酶能切掉这一部分单链环，用

连接酶连接后测定剩下的杂种双链中DNA的外显子序列，与基因组中原基因序列

比较就能准确知道内含子的位置和序列。

另外利用S1核酸酶降解杂交链中的单链部分这一特点，也可以在精确测序

前初步判定mRNA在基因组DNA上的相对应位置。首先在DNA上确定一个限制性

内切酶位点作为参照，用该酶切后得到两段DNA。将这两段分别与相同的mRNA

杂交，不能杂交的DNA和RNA单链部分可以被S1核酸酶降解。把留下的双链部

分电泳后，就能大概知道这茂个双链部分的长度是多少bp。从而判断出mRNA相

对于这个限制性内切酶的切点的位置，即覆盖了该切点上游多少个bp、下游多

少个bp或完全不包括这个酶切位点。

图3.15利用S1核酸酶初步判断mRNA在基因组DNA上的相对应位置

3.4.1.2Bal31核酸酶

基因操作中用到的另一种单链核酸内切酶是Bal31核酸酶。但这个酶同时也

具有双链特异的核酸外切酶活性。它是从埃氏交替单胞菌（Alteromonas

espejiana）中分离出来的。其双链核酸外切酶活性从冢和5c两末端移去核甘酸

降解双链DNA,单链内切酶活性切断双链DNA上对应于单链缺口的另一条链上未

配对的单链区域（图3.16）,类似于S1核酸酶。

Bal31核酸酶的活性需要Ca?.和hkf离子，在反应混合物中加入EGTA（乙二

醇双四乙酸）便可终止它的活性。由于EGTA是Ca"离子的专门螯合剂，它不会

改变溶液中Mg"离子的浓度，因此能够在不影响以后加入的需要卜靖,的核酸内切

限制酶活性的情况下，终止Bal31核酸酶的作用，便于控制其降解进度。

图3.16Bal31核酸酶的活性

Bal31核酸酶在基因操作中的用途就是利用了EGTA能够在不影响以后加入

的核酸内切限制酶活性的情况下终止其作用这一便利之处，用Bal31控制消化法

来测定线性DNA片段上的限制性内切酶位点顺序。用Bal31核酸酶消化一段DNA

双链，并在间隔一定的时间段后加入EGTA终止其反应，然后用某种限制性内切

酶切割后电泳。将电用片段与未经Bal31核酸酶消化的原始DNA片段的同一内切

酶切割电泳图谱对比就能推断出双链DNA片段经Ba⑶核酸酶消化后两头逐渐消

失的酶切位点的顺序。另外利用Bal31核酸酶这种可控制的双链外切酶活性也可

以有目的地将某一基因的一头缩短，制造缺失突变，以研究基因中不同区段的功

能。

也可以用Bal31核酸酶能识别双链DNA中的未配对单链部分而将之切断成为

线性分子来研究DNA的超螺旋状态。这一点也类似于S1核酸酶的作用。

3.4.2双链DNA内切酶

基因重组涉及最多的还是切割和连接DN