DB21T 2327-2014 猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测方法

ICS11.220B41DB21DB21/T2327—2014猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测方法MethodofrealtimefluozescentPCRforthedetectionofporcinecircovirustype2辽宁省质量技术监督局发布IDB21/T2327—2014本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：于学武、顾贵波、赵晓彤、崔基贤、陈瑶、魏澍、马建山、王竹、申贯男、赵凤菊、李璐、李晓楠、于丹、王海丰1DB21/T2327—2014本标准规定了猪圆环病毒2型（porcinecircovirustype2，PCV2）实时荧光PCR检测方法的实验技术要求。本标准适用于PCV2的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪脏器、血液、排泄物和细胞培养物中PCV2核酸的检测。本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本标准。PCV2：猪圆环病毒2型（porcinecircovirustype2）HSTaq酶：热启动TaqDNA聚合酶（HSTaqDNApolymerase）Ct值：达到阈值的循环数（cyclethreshold）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）实时荧光PCR：荧光聚合酶链式反应（realtimefluozescentquantitativepolymerasechainreaction）PBS：磷酸缓冲液（phosphatebuffersolution）4原理根据PCV2基因特定序列的保守片段，合成一对特异性引物和一条特异性探针。荧光探针的5’端标记FAM荧光素，3’端标记TAMRA荧光素，3’端的淬灭基团在近距离内能吸收5’端报告荧光基团发出的荧光信号。但在扩增时，由于Taq酶的5’→3’的外切活性，在延伸到荧光探针时，将探针切断，两基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生。因此，可通过检测荧光信号对核酸进行检测。5仪器和器材5.1仪器主要仪器有分析天平、高速离心机、荧光PCR扩增仪、-70℃冰箱、-20℃冰箱、水浴锅、可调移液器（最大量程为2μL，20μL，200μL，1000μL）。2DB21/T2327—20145.2器材主要器材有组织匀浆器或研钵、眼科剪、眼科镊、10mL一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、PCR八联排管或96孔板、吸头（10μL，200μL，1000μL）、灭菌双蒸水、称量纸。6试剂和材料6.1DNAzol®Reagent：DNA抽提试剂，外观为淡绿色，于4～8℃保存。6.2PremixExTaqTM（ProbeqPCR）：TaqMan探针法进行RealtimePCR反应的专用试剂，为PCRBuffer、dNTP、RNaseH和HSTaq酶的预混液，于-20℃长期保存，融化后于4～8℃保存。6.3PBS：磷酸盐缓冲液（0.02mol/LpH7.2）。6.4无水乙醇：-20℃预冷。6.575%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。6.6阴性对照：灭菌双蒸水。6.7阳性对照：PCV2细胞培养物。注：本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯。7操作步骤7.1样品的采集、前处理、存放和运送7.1.1采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。7.1.2采样工具药匙、15mL离心管和1.5mL离心管经121(±2）℃高压灭菌15min；剪刀、镊子经160℃干热灭菌2h。7.1.3内脏样品的采集与前处理采取病死或剖杀猪主要脏器（淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏和肝脏）装入灭菌15mL离心管中，编号，送实验室。取100mg左右待检样品，按1:5倍体积加入PBS，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，1000g离心15min，取上清液，转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.4血液样品的采集与处理用无菌注射器采集血液，注入含1/104%EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀，编号备用。7.1.5粪便的采集与前处理3DB21/T2327—2014用药匙采取猪新鲜粪便，装入15mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入PBS，混匀，1000g离心15min，取上清液，转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.6细胞培养物细胞培养物冻融3次，转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.7存放与运送采集或处理的样品在2~8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6~8h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7.2实时荧光PCR检测7.2.1DNA提取在核酸提取室进行。7.2.1.1取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照+阴性对照，对每个离心管进行编号。7.2.1.2每管加入800μLDNAzol，分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各200μL，颠倒10次混匀，室温静置5min；4℃10000g离心10min。7.2.1.3取900μL上清，置新的1.5mL灭菌离心管中，加入500μL无水乙醇，混匀，室温放置3min；4℃10000g离心5min。7.2.1.4弃上清，沿管壁缓缓加入1mL75%乙醇，混匀，4℃10000g离心5min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干（以无乙醇味为准）。7.2.1.5用20µL灭菌双蒸水溶解沉淀，于-20℃冰箱保存备用。7.2.2扩增体系的配制在配液区进行。设实时荧光PCR反应数为n，其中n为待检样品数+阳性管数+阴性管数，每个样本检测反应体系配制见表1，向每个荧光PCR管或孔中分装23µL的反应体系。4DB21/T2327—2014表1每个样品反应体系配制表体系组分用量终浓度备注PremixExTaq（ProbeqPCR2×)12.5µL上游引物F0.75µL0.6μmol/L下游引物R0.75µL0.6μmol/L荧光探针溶液0.5µL0.2μmol/LROXReferenceDye（50×)0.5µL仅使用在ABI、Stratagene等灭菌双蒸水8.5µL/8µL 总量23µL—7.2.3加样在样本处理区进行。在各设定的荧光PCR管中加入7.2.1中制备的2µLDNA溶液。盖紧管盖，除气泡、离心。7.2.4荧光PCR扩增检测在扩增室进行。7.2.4.1将7.2.3中离心后的PCR管放入荧光PCR扩增仪内，注意检查各反应管是否盖紧，记录样品摆放次序。7.2.4.2反应条件设置：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。荧光信号收集设置在每次循环的退火延伸时进行。8结果判定8.1阈值设定试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。8.2质控标准8.2.1阴性对照无Ct值，且无典型扩增曲线。8.2.2阳性对照Ct值应<30.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次试验视为无效。8.3结果描述及判定8.3.1阴性无Ct值并且无典型的扩增曲线，表示样品中无PCV2核酸。5DB21/T2327—20148.3.2阳性Ct值≦35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在PCV2核酸。8.3.3可疑Ct值>35.0，且出现扩增曲线的样本判定为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果Ct值≦35.0并出现典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。6DB21/T2327—2014（规范性附录）A.10.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）的配制A.1.10.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H20）71.64g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.1.20.2