2.1微生物的实验室培养课件

到目前为止，几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖都与微生物学有关2.1微生物的实验室培养课题1微生物的实验室培养专题2微生物的培养与应用2.1微生物的实验室培养课题背景19世纪中期，关系到法国经济命脉的酿造业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中，出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。经过一番研究，法国科学家巴斯德发现导致生产失败的根源在于发酵物中混入了杂菌。由此人们意识到保持培养物纯净的重要性。防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。一方面需要为培养的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面需要确保无处不在的其他微生物无法混入。2.1微生物的实验室培养一、基础知识：（一）培养基

人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。培养基就是微生物生存的环境和营养物质2.1微生物的实验室培养

液体培养基：（一般用锥形瓶盛装;常用于工业生产）

固体培养基：（一般用试管或培养皿盛装，在液体培养基的基础上再添加凝固剂琼脂;用于微生物的分离、计数、鉴定）

半固体培养基:（加少量琼脂，用于观察微生物的运动）1.培养基的种类(1)按物理状态分：2.1微生物的实验室培养固体培养基液体培养基2.1微生物的实验室培养(2)按功能分：选择培养基：加入某种化学物质，从众多微生物中分离出所需微生物鉴别培养基：加入某种试剂，鉴别不同种类的微生物2.1微生物的实验室培养2.培养基的基本成分：碳源、氮源、水、无机盐⑴碳源无机碳源：有机碳源：CO2、CO32-、HCO3-牛肉膏、糖、脂肪酸自养微生物异养微生物⑵氮源无机氮源：有机氮源：NH4＋、NO3-、N2牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等讨论1：回忆有关活细胞中元素组成的知识，想一想为什么大多数培养基都含有这四类物质？2.1微生物的实验室培养组成生物体最基本的元素是:C、H、O、N注：含CHON的如蛋白质，可以作为异养微生物的碳源、氮源和能源。2.1微生物的实验室培养1000mL牛肉膏蛋白胨固体培养基配方培养基组分提供的主要营养牛肉膏5.0g碳源、氮源、磷酸盐和维生素蛋白胨10.0g

氮源、维生素、碳源NaCl5.0g

无机盐H2O

定容至1000ml

氢元素、氧元素

除此之外，还需要满足微生物生长对特殊营养物质（例如:生长因子，即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物，如维生素、某些氨基酸等）

pH以及氧气等要求。2.1微生物的实验室培养加入青霉素的培养基:不加氮源的无氮培养基:不加含碳有机物的无碳培养基:

几种选择培养基举例：分离酵母菌、霉菌等真菌分离固氮菌

分离自养型微生物唯一碳源为纤维素的培养基分解纤维素的细菌2.1微生物的实验室培养3.培养基配制原则⑴目的明确：⑵营养全面、浓度适宜、比例恰当⑶适宜的pH值：有机碳源异养型：根据微生物的种类、培养目的选择原料自养型：不加碳源加入缓冲剂细菌中性或微碱，真菌酸性（CO2碳源）生产科研固氮型：不加氮源2.1微生物的实验室培养（二）无菌技术

无菌技术泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法技术。

获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，无菌技术就是防止杂菌污染的操作技术。2.1微生物的实验室培养（1）对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。（2）将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。（3）为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。（4）实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。无菌技术，主要包括以下几个方面：2.1微生物的实验室培养耐高温需保持干燥的物品，160～170℃1～2小时接种环、接种针等金属用具70~75℃、30min80℃、15min100℃、5~6min消毒灭菌定义方法较为温和理化方法，杀死部分有害菌体（不包括芽孢、孢子）强烈的理化方法，杀死所有微生物（包括芽孢、孢子）煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂紫外线灼烧灭菌干热灭菌酒精、氯气、石炭酸等高压蒸汽灭菌培养基，100KPa、121℃、15～30min消毒与灭菌：2.1微生物的实验室培养芽孢

有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。

细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖或休眠作用的生殖细胞。能直接发育成新个体。孢子2.1微生物的实验室培养请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手思考2.1微生物的实验室培养1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g琼脂20.0g二.实验操作：㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.计算：培养基用量依配方比例计算各成分的用量2.称量：3.溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸、少量水加热溶解→取纸→蛋白胨、NaCl→琼脂→补水定容4.调pH、分装、棉塞封口、包扎：5.灭菌：6.倒平板：培养基、培养皿2.1微生物的实验室培养倒平板约50℃等约5——10分钟后，将平板倒置灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基2.1微生物的实验室培养1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？问题讨论

答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。2.1微生物的实验室培养3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？

答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，又可防止培养基水分过快挥发。

答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。2.1微生物的实验室培养单个细胞或少数菌体(2).特征：大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。(3).功能：(1).菌落定义：鉴定菌种的重要依据固体培养基上大量繁殖子细胞群体㈡纯化大肠杆菌：分散成单个细胞,形成单个菌落2.1微生物的实验室培养㈡纯化大肠杆菌：⑴平板划线法：菌种划3个平板1个不划线1.接种方法：接种环防止划破培养基（重复实验）（空白对照）2.1微生物的实验室培养微生物的恒温培养微生物的恒温培养2.1微生物的实验室培养微生物的恒温培养2.1微生物的实验室培养问题讨论1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物杀死上次残留的菌种，保证使下一次划线时，菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.1微生物的实验室培养2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2.1微生物的实验室培养4.平板划线时不能划破培养基的原因：一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。2.1微生物的实验室培养6支试管，分别加入9ml无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液：菌液微量移液器2.1微生物的实验室培养⑵稀释涂布平板法：a.梯度稀释菌液：b.涂布平板：不超过0.1ml各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照滴灼试涂稀释103倍稀释104倍稀释105倍2.1微生物的实验室培养微生物的恒温培养2.1微生物的实验室培养涂布平板操作讨论思考：

涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？

应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。2.1微生物的实验室培养⑴平板划线法：二.实验操作：㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基㈡纯化大肠杆菌：1.接种：⑵稀释涂布平板法：2.培养：将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37℃恒温箱中培养12h～24h后，观察并记录（可观察是否有杂菌生长）2.1微生物的实验室培养两种接种方法形成的菌落2.1微生物的实验室培养三、课题成果评价

（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同2.1微生物的实验室培养四、课题延伸——菌种的保藏：1.临时保藏：试管固体斜面培养基上4℃2.长期保存：菌种易被污染、变异甘油管藏1ml甘油＋1ml菌液－20℃搁置斜面2.1微生物的实验室培养本课题知识小结:2.1微生物的实验室培养今天你很棒，继续加油哦！2.1微生物的实验室培养将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环_______在_______旁冷却接种环，并打开棉塞将试管口通过火焰.将已______的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划__________条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。.将试管通过火焰，并塞上棉塞火焰冷却三至五