未折叠蛋白反应与女性生殖障碍的研究进展2024（全文）

未折叠蛋白反应与女性生殖障碍的研究进展2024(全文)子伴侣与蛋白折叠酶的表达，调整蛋白折叠、胞内环境的稳态[1]。UPR是一种细胞面对应激刺激时所作出适应性改变的生理性应答，若其在内质网与线粒体响应不细胞稳态失衡，并诱发炎症、代谢及衰老相关表明UPR在女性正常生殖过程中发挥重要作用，UPR异常可能会导致卵巢早衰(prematureovarianfail通过其发生细胞器的不同可分为内质网未折叠蛋白反应(endoplasmicreticulumunfoldedproteinresponse,UPRer)与线粒体未折叠蛋白详见图1。线粒体基质ATF6PERK细胞核相关降解程序相关降解程序心长正确折叠NRF1R样内质网激酶；IRE1示I型内质网跨膜蛋白激酶；SIP示位点1蛋白酶；S2P示位点2蛋白酶；RIDD示调控IRE1依赖性衰变；ERSE示内质网应激反应元件；eiF2a示真核细胞起始因子2α;XBP1示X盒结合蛋白1;HSP示热休克蛋白；CLPP示ATP依赖性蛋白水解酶；LONP1示Lon蛋白酶1;CHOP示CEBP同源蛋白；PKB示磷酸激酶B;ERα示雌激素受体α;FOX03A示叉头样转录因子3A;NRF1示核呼吸因子1;SOD2示超氧化物歧化酶2;SIRT示去乙酰化酶图1未折叠蛋白反应分类与其信号通路途径1.UPRer:内质网作为真核细胞的关键细胞器，是蛋白质合成、加工与修饰的核心场所，并在脂质合成、钙离子贮存以及糖原合成与分解过程中发挥着至关重要的作用[3]。内质网使蛋白质的折叠能力及新合成的蛋白质量处于动态平衡——当内质网受到氧化应激、钙离子失衡及炎症刺激等因素影响时，内质网中蛋白质加工受阻，为避免未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网中积聚，细胞会启动UPRer,促进细胞核中分子伴侣及蛋白折叠酶表达，以缓解内质网应激(endoplasmicreticulumstress,ERS)压力，确保内质网的正常运转[4]。这一过程涉及细胞质与细胞核双向通信，通过增强蛋白质折叠能力、加速错误折叠的蛋白质降解等方式释放内胞凋亡[5]。kinaseR-likeendoplasmicreticulumkinase,PERK)通路与I型内路的协同激活，共同促进UPRer的发生[7]。位点2蛋白酶(site2protease,S2P)切割和修饰。这一过程会产生具反应元件(endoplasmicreticulumresponseelement,ERSE)上的蛋白质的正常加工[9-10]。核细胞起始因子2a(eukaryoticinitiationfactor2a,eiF2a)的第51酸化，此时通过其内切酶活性剪切X盒结合蛋白1(X-boxbindingprotein1,XBP1)mRNA中切酶还可以剪切内质网相关mRNA,通过调控IRE1依赖性衰变(regulatedIRE1-dependent(proteindisulfide质网腔内伴侣蛋白47,与BIP竞争性结合IRE1,使BIP与IRE1解离，成分或物理性质改变造成的细胞应激称为脂双层应激(lipidbilayerstress,LBS),以区别于ERS,并认为LBS激活跨膜蛋白感受器的机制不同于ERS,但仍需进一步研究探索[19]。核连蛋白1(nucleobindin1,NUCB1)是首次被确定的定位于高尔基的切割修饰作用，从而阻止ATF6的激活，负调控UPRer减弱PERK信号通路转导，从而负反馈调控UPRERβ的5种亚型之一，它是野生全长型ERβ,编码含530个氨基酸的蛋 转录因子应激相关激活转录因子-1(activatingtranscriptionfactorassociatedwithstress-1,ATFS-1)的双向定位所调控[28]。相比于线虫，哺乳动物细胞中的线粒体功能更为复杂及多样化，并存在多条及C/EBP同源蛋白(C/EBPhomologousprotein,CHOP)的YME1L1)的启动子上，从而促进诱导线粒体HSP与蛋白酶表达，增强线粒体内部的蛋白折叠能力[29-31]。UPR。当错误折叠的蛋白质在线粒体内膜间隙大量积累时，致使活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)依赖性的磷酸激酶B(proteinkinaserespiratoryfactor1,NRF1)转录激活以促进蛋白酶表达与激活蛋白酶体活性，调节线粒体呼吸链功能与线粒体蛋白质量水平[32-33]。也参与调控UPRmt[34]。SIRTs是一类进化上高度保守的NAD+依赖表达由线粒体内积聚的未折叠与错误折叠蛋白质蛋白未折叠毒性应激时，SIRT1/SIRT3被激活从而介导叉头样转3A(forkheadboxO3A,FOXO3A)去乙酰化并重新定位至细胞核，诱导超氧化物歧化酶2(superoxidedisumtase2,SOD2)和过氧化氢复正常[34]。SIRTs信号通路是通过抗氧化作用，保护细胞免受ROS应激，从而从根源上抵抗潜在的错误折叠蛋白与未折叠蛋白的积聚。性氧(mitochondrialreactiveoxygen粒体蛋白前体(mitochondrialproteinc-mtProt)的积累[35]。当细胞受到应激刺激，细胞质中mtROS的表proteinfamily氧化细胞质中的DNAJA1,进而增强细胞质中HSP70对c-mtProt的招募，也因此，原本与HSP70结合的热休克转录因子1(heatshock人员通过计算机筛选并设计一种与HSP60顶端结构域相结合的药理学抑制剂DCME1,可破坏HSP60与CLPP的相互作用，抑生，导致肿瘤细胞在体内无法生长存活[36]。在亨廷顿舞蹈症(Huntington'sdisease,HD)中也发现HD细胞中亨廷顿蛋白突变可使细胞中线粒体HSP60与CLPP的表达下降，抑制UPRmt的激活，这可能是导致该疾病患者线粒体功能异常的发生机制之一[37]。在乳腺癌中发现，癌细胞中存在SIRT3/FOXO/SOD2轴激活导致的UPRmt可使癌细胞对顺铂的敏感性下降，而SIRT3沉默可通过抑制UPRmt信号来恢复其对化疗的敏感性，防止癌细胞进展，然而其具体机制尚不明确[38]。如前文所述，DNAJA1在UPRmt中可作为HSF1的上游信号，感受氧化还原变化，增强细胞质中HSP70对线粒体蛋白前体的招募作用，同时释放HSF1,激活UPRmt基因转录。最新研究显示，在HeLa细胞中敲降DNAJA1的表达，可通过抑制HSF1的核转位，有效抑制UPRmt转但其抑制作用的效力仍需更多的研究证明[35]。二.研究UPR的常用技术方法1.检测UPR关键信号分子：在目前研究中，判断UPR是否被激活最常用的检测方法即分析细胞中UPR信号通路关键调控分子的转录及蛋白水在UPRer中，可通过实时荧光定量聚合酶链式反应及免疫分析如免疫印迹法或免疫荧光法标记分析UPRer中的主要信号分子如BIP、ATF6、IRE1、XBP1、CHOP等。然而，单独的UPRer标志物水平分析并不能直接判断它的激活或抑制。由于UPRer通常由3条关键反应通路的协同与UPRer研究方法类似，判断细胞中UPRmt是否被激活或抑制，主要也是通过分析UPRmt相关反应标志分子的mRNA或蛋白水平。例如分析UPRmt经典通路中的关键核转录分子ATF4、ATF5、CHOP,伴侣蛋蛋白水平变化是目前科学研究中常用的技术方法之一。此外，分析评估ERa的磷酸化水平及其下游NRF1的mRNA与蛋白表达水平则可判断是否通过ERa信号通路途径介导UPRmt的激活。2.直接检测未折叠蛋白质：当细胞受到应激刺激时，细胞会启动UPRer间接判断UPR的激活状态。马来酰亚胺修饰四苯乙烯(tetraphenylethenemaleimide,TPE-MI)是一种测定细胞内未折叠硫醇结合。正常情况下硫醇通常埋在球形蛋白质白质反应增强，因此可通过分析TPE-MI荧光水平判断细胞中未折叠蛋白(ER-tracker、mito-tracker)进行共定位分析，以此直观判断UPRer与UPRmt的未折叠蛋白水平。1.UPR与卵母细胞成熟：卵巢的主要功能包括卵母细胞发育及排卵的生期之后，始基卵泡被陆续募集并发育为成熟卵泡后排出体外[40]。从始基卵泡发育为排卵前卵泡的成熟过程中，卵母态、位置及功能上的改变，例如在细胞质中出目也逐渐增加，并出现线粒体嵴等[41-42]。多项研究表明，UPR信号会影响卵母细胞的成熟及后续的胚胎发育[43-48]。在卵母细胞成熟过程中，内质网作为蛋白质与脂减数分裂过程，在母猪的卵丘-卵母细胞复合物(cumulus-oocyteATF6的蛋白水平显著增加[43]。在小鼠GV期卵母细胞向MI期卵母管，提示UPRer在卵母细胞成熟过程中激活[44]。然而，若ERS过度激活致使错误折叠蛋白与未折叠蛋白在内质网中持续积累且无法通过酸蛋白酶-12(cysteine-containingaspartate-specific程中，线粒体数目从胚胎原始生殖细胞中的10个左右可增长至大约100激素(follicle-stimulatinghormone,FSH)与黄体生成素(luteinizing颗粒细胞膜上的卵泡刺激素受体(follicle-stimulatinghormonereceptor,FSHR)和黄体生成素受体(luteinizinghormonereceptor,用，最终造成卵泡发育及性激素合成异常[52]。3.UPR与子宫内膜容受性：在胚胎植入时期，子宫内膜微环境会经历一细胞因子、黏附分子、免疫因子等多种调控作为UPRer关键蛋白，BIP在子宫内膜腺上皮及基质细胞中均有表达，且其表达水平随着月经周期的改变而改变。在期，子宫内膜BIP表达水平较其他时期显著升高[54],这可能与该时期低水平雌激素引起的炎症激活状态有关。研究表平状态时，子宫内膜对白细胞的招募增加，诱导升高，继而激活ERS与UPRer信号通路[55]。而在小鼠子宫中，雌激素可促进内膜基质细胞中BIP的表达，激活UPRer,并通过改善内质网做准备[56]。在山羊子宫内膜上皮细胞中，当使用UPRer激活剂处理细胞时，可显著增加UPR标志蛋白BIP、CHOP、ATF6、IRE1的蛋白表达水平，上调下游信号分子前列腺素E2与前列腺素F2a比值，从而促进合体滋养细胞黏附能力，调控胚胎植入[57]。1.POF:POF是指女性卵巢功能减退导致在40岁前出现超过6个月以上的闭经，伴有FSH水平升高及雌激素水平降低的现象[58]。POF严重影响患者的生殖功能及生活质量，近年来，研究表明UPR与卵巢储备密切相关[59-60]。育。研究显示，POF患者早期闭锁卵泡的颗粒细胞中BIP的表达水平升但若卵泡进一步闭锁，BIP表达量则显著下调，由过度的ERS引起的水平降低，导致卵母细胞耗竭[59]。因此ERS引起的过度UPRer与卵UPRmt作为线粒体保护性反应也在卵巢生殖储备过程中发除Clpp,出现了卵子耗竭，并产生了类似于POF的临床表型。在小鼠Clpp敲除后，卵丘细胞中的线粒体超微结构异常造成线粒体动力学相关基因表达减少且卵丘复合体凋亡显著增加、增与功能的显著变化[60],可能是小鼠卵子耗竭的原因。发生、发展过程中发挥关键作用[62-65]。研究表明，在PCOS临床患者卵巢颗粒细胞中UPRer相关活化标记分子如BIP、XBP1、CHOP的蛋白水平显著高于正常女性，提示UPRer在PCOS颗粒细胞中显著激活[62].尽管UPRer是一种内质网保护性反应，但如前文所述，其过度激活会导致颗粒细胞凋亡及中ATF4相关的PERK信号通路可通过诱导下游Notch同源物2信号调小鼠中观察到，ATF4功能异常可能造成COC扩张减少，导致排卵障碍[64]。另外，在PCOS患者中观察到持续及过度的ERS反应可能通过而加剧卵巢纤维化，造成排卵障碍及性激素合成紊乱[65]。3.子痫前期(preeclampsia,PE):PE是以高血压与蛋白尿为主要临床表现的严重妊娠期并发症。氧化应激诱导母体血旋动脉重塑障碍造成胎盘血流灌注不足是造成PE发病的重要原因[66]。盘发育等过程，可能是造成PE发病的重要原因[66]。与胎盘形成，还可通过激活XBP1的翻译促进胎盘组织中血管内皮生长因Iwawaki等[68]研究中，敲低UPRer关键信号分子IRE1可使小鼠VEGFA表达下调，造成子宫螺旋动脉重塑异常，从而导致PE