分子生物学-第5章-分子生物研究法(上)

第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术 从20世纪中叶开始,分子生物学研究得到高速发展,主要原因之一是研究方法,特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等,是分子生物学研究的核心技术。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子,构成遗传物质的新组合,使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分,只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上,这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力,是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。5.1重组DNA技术回顾5.2DNA基本操作技术5.3RNA基本操作技术5.4SNP的理论与应用5.5基因克隆技术5.6蛋白质组与蛋白质组学技术三大成就:1.40年代确定了遗传信息的携带者,即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题；BacterialStrainInjectionResultsLivingScellsLivingRcellsHeatkilledScellsHeatkilledScellsmixedwithlivingRcellsLivingScellsinbloodsamplefromdeadmousecapsule1928FrederickGriffith&1944OswaldAveryTransformationofStreptococcuspneumoniae5.1重组DNA技术回顾1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验2.50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklinMauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&WilkinsDescriptionofthe3-DstructureofDNAFrancisCrick&JamesWatsonConservativeModelSemiconservativeModelFrankStahlMattMeselsonParentcellFirstreplicationSecondreplication1958-MatthewMeselson&FranklinStahlprovedthatDNAreplicationinbacteriafollowsthesemiconservativepathway3.50年代末至60年代,相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码,充分认识了遗传信息的流动和表达。JacobandMonod但是,如果没有分离和富集单一DNA分子的技术,科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。两大技术保证:1.DNA的体外切割和连接1962年Arber发现限制性核酸内切酶,1967Gellert发现了DNA连接酶DNAligasecovalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3’5’3’5’HerbertBoyer,StanleyCohen1972年获得第一个重组DNA分子HerbertBoyer重组DNA实验中常见的主要工具酶酶

类功

能限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开DNADNA连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶I（大肠杆菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，补平DNA双链中的缺口反转录酶按照RNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNA链多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5'-OH末端（进行末端标记实验或用来进行DNA的连接末端转移酶在双链核酸的3'末端加上多聚单核苷酸DNA外切酶III从DNA链的3'末端逐个切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶从DNA链的5'末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶切除位于DNA链5'或3'末端的磷酸基团到目前为止,科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段,再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开,以供下一步研究。1972-PaulBerg,ProducedfirstrecombinantDNAusingEcoRIEcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需要。DNA片段在体外不具备自我复制能力,要想得到足够量和足够纯度的DNA,必须将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上（载体上）,并转入寄主细胞中进行繁殖。这就是基因克隆,或分子克隆。分子克隆的载体具备自主复制能力的DNA分子（vector）,如病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。从此,大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。1970年Mandel和Higa发现,大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后,能有效地吸收λ噬菌体DNA。1972年,Cohen等人又报道,经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒DNA。1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies表明:

（1）像pSC101这样的质粒DNA分子可以作为基因克隆的载体,从而把外源DNA导入寄主细胞；（2）像非洲爪蟾这样的高等生物的基因也可以被成功地转移到原核细胞中并实现其功能表达；（3）质粒DNA-大肠杆菌细胞作为一种成功的基因克隆体系,有可能在重组DNA或基因工程研究中发挥重要作用。2.DNA的核苷酸序列分析技术DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的DNA技术学,这门技术,对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系,以及克隆DNA片断的操作方面,都有着十分广泛的使用价值。重组DNA技术历史上的主要事件年份事

件

1869FMiescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1944O.T.Avery证实DNA是遗传物质。1952A.D.Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。1957A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。1958M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留复制模型。1959-1960S.Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破译了第一相遗传密码；F.Jacob和J.Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。1964

C.Yanofsky和S.Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。1965

S.W.Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。1966

M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。1972-1973H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。1978

首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster获得转基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到转基因果蝇。1982美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。1983

获得第一例转基因植物。1984

斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。1986

GMO首次在环境中释放。1988

J.D.Watson出任"人类基因组计划"首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠--"Oncomouse"。1992

欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定。1994第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2000完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定。2001完成第一个人类基因组全序列测定。2004中国科学家完成家蚕基因组全序列测定。2005中、美、日科学家联合完黑猩猩基因组全序列测定。限制性核酸内切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶分类:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名Hin

dⅢ

属

系

株序Haemophilus

influenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)即反相重复结构,是DNA分子中以某一处为轴,其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。切口:平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口DNA连接酶:通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片断连接成一个整体DNA分子。T4¯DNA连接酶EcoRI连接酶T7¯DNA连接酶目的基因的来源原核细胞真核细胞:cDNA或gDNA文库人工合成及PCR扩增目的基因天然DNA（染色体DNA.病毒DNA(噬菌体DNA)、质粒DNA.线粒体DNA和叶绿体DNA）重组实验中的主要载体定义:为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物,便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点）,常具有多个单一酶切位点,称为多克隆位点；分子量小,以容纳较大的外源DNA。噬菌体载体:双链DNA病毒，约50kb,两端有一个12个核苷酸5′端突出粘性末端λ噬菌体黏粒、YAC.BAC：高容量载体个克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小质粒:10kbλ噬菌体:23kb黏粒:45kbBAC:350kbYAC:1000kb

以质粒为载体的DNA

克隆过程细菌转化转化（transformation）:P151感受态细胞（Competentcells）:受体细胞经过一些特殊方法（如:CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许有外源DNA的载体分子通过，处于这种状态下的细胞称~将异源DNA分子引入一细胞株系,使受体细胞获得新的遗传性状转导？转染？常用的转化方法:化学转化（CaCl2）法电击法化学转化原理:在0℃冷冻处理时，处于CaCl2低渗溶液中的大肠杆菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的热冲击下，细胞吸收外源DNA，然后在丰富培养基内复原并增殖，表达外源基因。电击转化:使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。菌液:生长对数期场强(最大转化效率):12.5-15kV/cm温度:0-4℃克隆的筛选:抗生素基因。常用的抗生素有:氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等-互补蓝白斑筛选营养条件（自养、异养）-互补筛选

β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞IPTG/X-gal的培养基上筛选蓝白斑蓝白斑筛选LacZ,IPTG

X-galX+gal

（白色）（蓝色）

LacZ（失活）,IPTG

X-galX-gal

（白色）（白色）

蓝白斑Generalprocessofgeneengineering1.从生物有机体基因组中,分离出带有目的基因的DNA片段。2.将带有目的基因的外源DNA片段和载体分别进行酶切。4.将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。5.从大量的细胞繁殖群体中,筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞,并筛选出已经得到扩增的目的基因。3.将酶切片段与具有选择记号的载体连接,形成重组DNA分子。5.1重组DNA技术回顾5.2DNA基本操作技术5.3RNA基本操作技术5.4SNP的理论与应用5.5基因克隆技术5.6蛋白质组与蛋白质组学技术5.2

DNA基本操作技术

5.2.1

核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如:DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。

一种分子被放置到电场中,它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度,叫做电泳的迁移率,它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。就是说,电场强度越大,电泳分子所携带的净电荷数量越多,其迁移的速度越快,反之则较慢。由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质,如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等,故电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数,因此,根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所带的净电荷的多寡,便可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离开来。基本原理在生理条件下,核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团,是呈离子化状态的,所以,DNA和RNA多核苷酸链又被称为多聚阴离子（polyanions）,把这些核酸分子放置在电场当中,它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下,DNA分子的这种迁移速度,亦即电泳的迁移率,取决于核酸分子本身的大小和构型。大分子量的DNA移动的慢小分子量的DNA移动的快电泳缓冲液阳极阴极DNA加样孔琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关,凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。反之,浓度降低,孔隙就增大,其分辨能力也就随之减弱。在凝胶电泳中,加入适量溴化乙锭（ethidiumbromide,简称EtBr）染料对核酸分子进行染色,然后将电泳标本放置在紫外光下观察,可十分灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位,即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA,也可以被清晰地检测出来。在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNA分子发出荧光称样溶解加热制板倒胶电泳操作基本程序取样点样电泳检测结果将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起,其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体,所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。5.2.2核酸的分子杂交

不同温度下DNA的构型变化一DNA/DNA的杂交作用,可以用来检测特定生物有机体之间是否存在着亲缘关系,而形成DNA/RNA间杂种分子的能力可被用来揭示核酸片段中某一特定基因的位置。

不同温度下DNA的构型变化二在大多数核酸杂交反应中,经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子,都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上,而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的,因此,核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。SouthernBlottingE.M.Southern于1975年首先设计出来的。材料:尼龙滤膜硝酸纤维素滤膜二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）步骤:第一,将分离的核酸样品转移到固体支持物滤膜上－核酸印迹转移电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法第二,是将具有核酸印迹的滤膜与带有放射性或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交杂交模式图放射自显影DNA印迹转移探针杂交－＋SouthernBlotting的过程1.提取DNA,酶解；2.琼脂糖凝胶上电泳分离；3.转印（转移）DNA4.固定膜上的DNA5.预杂交和杂交（放射性和荧光检测）6.洗膜7.显影检测（放射性/酶促）Southernblot转移装置图在理想条件下,应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术,即便每带电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来。由于放射性同位素对人体的危害,近年来又发展了荧光法检测杂交信号的技术,虽然灵敏度略低于同位素法,却使核酸杂交实验变得更为安全。常用的荧光染料:C5.C3等NorthernHybridization

IsolatemRNA(DifferentLengths)ProbewithlabeledDNA是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上,进行核酸杂交的一种实验方法。类似于Southernblot,但用于检测RNA的分子杂交技术,用于分析总RNA或mRNA1）RNA提取2）RNA电泳（分离不同长度RNA)3）转膜(形成固相RNA)4）探针标记（同位素/非同位素）5）预杂交,杂交6）洗膜7）显影（放射性/酶促）步骤YLNSESLSMKK9MPK1MPK3MPK618SrRNAMPK7Northern5.2.3

聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制,它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983年由Dr.KaryB.Mullis提出,并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后,PCR技术在生物科学研究和应用中得以广泛应用,成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。1.变性（90℃-96℃）在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂,形成单链DNA,称之为变性。2.退火（25℃-65℃）是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。3.延伸（70℃-75℃）从结合在特定DNA模板上的引物为出发点,将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。标准的PCR过程分为三步:PCR反应体系引物dNTPMg2+Taq聚合酶模板反应缓冲液引物设计的基本原则:1.引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38bp,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。2.引物序列3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外,两条引物3’端若互补,或者单条引物自身形成发夹结构也可能导致PCR反应失败。4.5’端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5‘端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。5.引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应,因为GC含量决定了DNA双链的解链温度（Tm）。另外,上下游引物的GC含量不能相差太大。6.一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。用NaOH

将pH调至7.0。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。理论上4种dNTP各20μmol/L,足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。

dNTPPCR反应体系-Mg2+Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,Mg2+浓度过低,会显著降低酶活性;Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg2+浓度还影响引物退火和解链温度以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L,1.5mM最佳。PCR反应体系-Taq聚合酶扩增效率最高,1000bp/min

活性

5’-3’DNA聚合酶活性强

无3’-5’DNA外切酶活性,错配率每个循环约1/6000

3’末端加“A”,产物可直接进行“TA”克隆pfu酶——保真度高原理:具3’－5’核酸外切酶活性,即校正功能。

效率相对较低,500bp/min3’末端不加“A”,加A后才可进行TA克隆。就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。一般反应中的模板浓度为50-100ng/ml。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率.PCR反应体系-模板DNAPCR反应体系—PCR反应缓冲液缓冲液一般含10-50mmol/LTris·Cl(20℃下pH8.3-8.8),50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+.另外,反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性。PCR反应参数:变性在第一轮循环前,在94℃下变性3-5min非常重要,它可使模板DNA完全解链。变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量。对于富含GC的序列,可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。

PCR反应参数:退火引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃,时间一般为20-60s。PCR反应参数:延伸延伸反应通常为72℃,接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度75℃。实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(5-10min)的延伸反应。以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。PCR反应参数:循环次数当其它参数确定之后,循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。如果此时产物量仍不够,需要进一步扩增,可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板,重新加入各种反应底物进行扩增,这样经60轮循环后,扩增水平可达109-1010。PCR反应程序:温度（℃）时间（min）94726094℃变性（0.5min）60℃退火（0.5min）72℃延伸（1min）循环1循环2循环394℃预变性（5min）PCR技术在基因克隆方面的应用

（1）目的基因的直接克隆,（2）通过RT-PCR进行cDNA的克隆；（3）制备DNA探针,进行分子检测等。5.2.4.实时定量PCR一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。实时荧光定量pcr技术中的一些重要因素:Ct值。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。可利用来计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量PCR中荧光化学，荧光定量pcr所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下:TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。SYBR荧光染料:在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。TaqMan荧光探针SYBR荧光染料5.2.5.基因组DNA文库的构建从生物组织细胞提取出全部DNA将其切成预期大小的片段,分别与载体连接,转入受体细菌或细胞,形成克隆。这样每一个细胞接受了含有一个基因组DNA片段与载体连接的重组DNA分子,而且可以繁殖扩增,许多细胞一起组成一个含有基因组各DNA片段克隆的集合体,就称为基因组DNA文库。如果这个文库足够大,能包含该生物基因组DNA全部的序列,就是该生物完整的基因组文库。基因组DNA文库可用于分离特定的基因片断、分析特定基因结构、研究基因表达调控、还可用于全基因组物理图谱的构建和全基因组序列测定。基因组DNA文库的构建过程5.1重组DNA技术回顾5.2DNA基本操作技术5.3RNA基本操作技术5.4SNP的理论与应用5.5基因克隆技术5.6蛋白质组与蛋白质组学技术5.3RNA基本操作技术5.3.1总RNA的提取RNA易遭降解，实验要求较严格。总RNA提取的方法有多种，主要有LiCl法、CTAB法、异硫氰酸胍法（TriZol）。异硫氰酸胍法（TriZol）原理:TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。5.3.2mRNA的纯化mRNA的分离方法较多,其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效,已成为常规方法。利用mRNA的PolyA结构,试剂盒提供一种生物素化寡聚dT引物,与PolyA杂交,形成生物素化寡聚dT-mRNA的杂交体,然后利用生物素与抗生物素蛋白的结合作用以链抗生物素-顺磁颗粒（SA-PMPs）结合杂交体,形成生物素化寡聚dT-mRNA-SA-PMPs复合物,再利用磁性吸附作用以磁性条吸附复合物中的SA-PMPs颗粒,最后利用高严紧度盐溶液中分子杂交体磁性减弱,杂交体中生物素化寡聚dT引物与mRNA分离,从而纯化得到mRNA。PolyATtractmRNA的分离纯化过程简图5.3.3cDNA的合成cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。第一链cDNA的合成是以mRNA为模板,反转录为cDNA,有反转录酶催化,该酶合成DNA时需要引物引导,常用引物是oligodT。第二链合成是以第一链为模板,由DNA聚合酶催化。5.3.4cDNA文库的构建cDNA文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典cDNA文库构建的基本原理是用Oligo(dT)作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。步骤:提取总RNA，在获得高质量的mRNA后，反转录合成cDNA，合成接头的加入、将双链DNA克隆到载体中去、分析cDNA插入片断，扩增cDNA文库、对建立的cDNA文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是λ噬菌体，这是因为λDNA两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。RNA分离富集5.3.5基因文库的筛选基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程。筛选方法有很多种，常用的有:核酸杂交法PCR筛选法免疫筛选法5.1重组DNA技术回顾5.2DNA基本操作技术5.3RNA基本操作技术5.4SNP的理论与应用5.5基因克隆技术5.6蛋白质组与蛋白质组学技术5.1重组DNA技术回顾5.2DNA基本操作技术5.3RNA基本操作技术5.4SNP的理论与应用5.5基因克隆技术5.6蛋白质组与蛋白质组学技术在多细胞的高等生物个体水平上,人们用克隆（clone）表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotictwins）便是属于同一克隆。在细胞水平上,克隆一词是指由同一个祖细胞（progenitorcell）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。在分子生物学上,人们把将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中,使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。5.5基因克隆技术分子克隆的主要方法（1）构建cDNA.核DNA文库，应用现有核酸探针分离新的目的基因；

（2）差式杂交(differentialscreen)和扣除杂交(subtractivehybridization)技术；

（3）DD-RT-PCR法及差别显示技术；

（4）差别分析法(RDA法，即Representationaldifferenceanalysis）；

（5）酵母双杂交体系Two-hybridsystem；

（6）图位克隆法（map-basedcloning）与染色体步移（genomicDNAWalking）。

5.5.1RACE技术RACE（RapidAmplificationofcDNAEnds）是用于从已知cDNA片段扩增全长基因的方法,它根据已知序列设计基因片段内部特异引物,由该片段向外侧进行PCR扩增得到目的序列。用于扩增5’端的方法称为5’RACE,用于扩增3’端的称为3’RACE。已知cDNA序列可来自序列表达标签、减法cDNA库、差法显示和基因文库筛选。5’RACE在反转录酶的作用下,以已知基因片段内部。特异性引物启始cDNA第一条链的合成RNase混合物降解模板mRNA,纯化cDNA第一条链。用末端转移酶在cDNA链3‘端加入连续的dCTP以连有oligo(dG)的锚定引物和基因片段内部特异的nested引物进行PCR扩增,以期得到目的片段,并可用nestPCR进行检测。3’RACE是在反转录酶的作用下,以连有可以和polyA配对的oligo(dT)的锚定引物启始cDNA第一条链的合成。用RNaseH降解模板mRNA。用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行PCR扩增得到目的3‘片段,并可用nestPCR的方法继续进行检测和扩增。5.5.2应用cDNA差示法分析克隆基因cDNA差示分析法（representationaldifferenceanalysis,RAD）充分发挥了PCR能以指数形式扩增双链DNA模板,仅以线形形式扩增单链模板的特性,通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法,特异性扩增目的基因片断。5.5.3Gateway大规模克隆技术Gateway克隆技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染色体之间发生的位点特异性的重组整合与切出反应。整合反应是由Int（integrase）和IHF（IntegrationHostFactor）催化的。attB和attP之间的重组整合的噬菌体基因组DNA的5’和3’端含有attL和attR位点。切出的