分子生物学第五章

第五部分分子克隆技术大肠杆菌基因组人类基因组真核细胞的基因及cDNAcDNADNA目的DNA片段分子克隆(Molecularcloning):产生许多相同的DNA分子的过程。分子克隆(Molecularcloning)基因组DNA载体限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切、电泳分离、纯化DNA连接酶重组载体转化或转导大肠杆菌宿主细胞细菌增殖分子克隆的基本过程重组载体在大肠杆菌宿主细胞中复制以产生许多相同的DNA分子拷贝完成分子克隆所需的条件

载体

目的DNA或cDNA

工具酶(限制性内切酶、DNA连接酶、修饰酶)

宿主细胞及导入重组DNA分子到宿主细胞的手段阳性克隆的筛选方法基因组测序特定基因的克隆、表达及功能鉴定基因诊断：疾病相关基因的检测，病原微生物的检测等

DNA指纹分析基因治疗重组病毒疫苗、DNA疫苗药物研发及药物生产转基因动、植物的产生微生物生产能源及处理环境废物分子克隆技术的应用利用大肠杆菌生产人胰岛素发酵装置人胰岛素载体和宿主细胞

(VectorsandHostcells)(一)克隆载体(Cloningvectors)

用于构建基因组文库、cDNA

文库以及克隆某一特定基因或cDNA

以测定其核苷酸序列。1.质粒(plasmid)2.噬菌体载体(

phage)3.粘粒(cosmid)4.细菌人工染色体(Bacterialartificialchromosome,BAC)5.酵母人工染色体(Yeastartificialchromosome,YAC)载体(Vectors)

(二)表达载体(Expressionvectors)

用于表达某一基因或cDNA

以获得目的蛋白。表达载体的种类较多，根据要表达的目的蛋白的特点对载体进行选择。1.原核表达载体(质粒)：用原核细胞表达目的蛋白2.真核表达载体(质粒)：用真核细胞表达目的蛋白

用于酵母的表达载体

用于昆虫细胞的表达载体

用于哺乳类细胞的表达载体功能分析结构分析药物筛选临床药物克隆目的基因或cDNA到克隆载体亚克隆目的基因或cDNA到表达载体表达目的蛋白基因治疗克隆载体 宿主细胞 载体结构 外源插入片段克隆质粒 大肠杆菌 环状质粒

0.1-10kb

噬菌体载体 大肠杆菌 线状病毒 8-25kb粘粒 大肠杆菌 环状质粒 35-45kb细菌人工染色体 大肠杆菌 环状质粒 50-300kb酵母人工染色体 酵母 线状染色体 100-1000kb克隆载体的类型低分子量、高拷贝数质粒：高拷贝数质粒可大量扩增被克隆的目的基因、DNA片段或cDNA。含有一个或几个可供选择的标记：抗生素的抗性基因、细菌的lacZ

基因片段及ccdB

致死基因等。含多克隆位点(Multiplecloningsite,MCS)：在质粒的选择性标记中有多个限制性内切酶单一识别位点，允许外源DNA插入。克隆质粒(Cloningplasmid)MCS(pUC18)ApR:Ampicillinresistancegenerep(ori):replicationoriginlacZ:N-terminal-galactosidaseMCS:multiplecloningsites基因组被改造的E.coli

菌株DH5

F-endA1glnV44thi-1recA1relA1gyrA96deoR

nupG

Φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169,hsdR17(rK-mK+),

-

JM109endA1glnV44thi-1relA1gyrA96recA1mcrB+Δ(lac-proAB)e14-[F'traD36proAB+

lacIqlacZΔM15]hsdR17(rK-mK+)

XL1-BlueendA1gyrA96(nalR)thi-1recA1relA1lacglnV44F'[::Tn10proAB+

lacIqΔ(lacZ)M15]hsdR17(rK-mK+)

用于基因克隆的大肠杆菌(E.coli

)菌株表达载体(质粒)原核细胞与真核细胞表达目的蛋白的特点大肠杆菌菌株(基因组被改造) BL21(DE3),CD41(DE3),ER2566酵母细胞

P.pastoris,S.cerevisiae,

S.pombe昆虫细胞系

Sf9,Sf21各种高等真核生物的组织细胞用于目的蛋白表达的宿主细胞构成原核表达载体的元件复制起始点多克隆位点(MSC)抗生素抗性基因启动子转录终止子有些载体具有核糖体结合位点(RBS)用于纯化目的蛋白的标签(tag)

His-tag6-10个His(组氨酸)与目的蛋白的N或C末端形成融合蛋白，便于用His-Ni或His-Co亲和层析法纯化目的蛋白；

GST(glutathioneS-transferase)GST与目的蛋白的N端形成融合蛋白，便于用

glutathione-Sepharose

纯化目的蛋白；

MBP(Maltosebindingprotein)MBP与目的蛋白的N端形成融合蛋白，便于用

amylose-Sepharose

纯化目的蛋白；

CBD-tagCBD(Cellulosebindingdomain)与目的蛋白的N端形成融合蛋白，便于用纤维素纯化目的蛋白。用于纯化目的蛋白的标签亲和层析真核表达载体为穿梭载体(shuttlevector)，既可在大肠杆菌中复制扩增(便于基因克隆)，又可在真核细胞中表达目的蛋白。用于大肠杆菌的复制起始点多克隆位点(MCS)

用于大肠杆菌的抗生素抗性基因；用于真核细胞的抗生素抗性基因启动子转录终止子添加PolyA

的信号序列构成真核表达载体的元件多克隆位点

Ampicillin,kanamycin,HygromycinB抗性基因用于E.coli

中复制的复制起点来源于SV40的复制起点

Neomycin,Zeocin,Blasticidin

抗性基因，用于筛选稳定表达细胞系

CMV(cytomegalovirus),SV40(Simianvirus40),RSV启动子

转录终止子

加PolyA

的信号序列哺乳类细胞表达载体用于基因治疗的病毒表达载体逆转录病毒载体(Retroviralvectors)

慢病毒载体(Lentivirusvectors)

腺病毒载体(Adenoviralvectors)

用于转基因动物的表达载体含组织表达特异性的启动子

用于噬菌体展示(PhageDisplay)的载体将目的基因插入噬菌体衣壳蛋白基因，形成的融合蛋白出现在噬菌体表面，目的蛋白或多肽保持相对独立的空间结构和生物学活性。其他特殊表达载体转化(Transformation)

将外源DNA导入细菌的过程。

化学法、物理法(电转化)

转染(Transfection)

将外源DNA导入真核细胞的过程。 化学法、物理法转导(Transduction)

利用噬菌体将外源DNA导入细菌的过程。感染(Infection)

利用病毒将外源DNA导入真核细胞的过程。载体导入宿主细胞的方法

CaPO4-DNA共沉淀法钙离子与DNA的磷酸基团结合形成不溶性沉淀CaPO4-DNA，并附着于细胞表面，通过细胞内吞作用被细胞所吸收。

DEAE-葡聚糖方法带正电荷的DEAE-葡聚糖与带负电荷的DNA磷酸基团结合形成DEAE-葡聚糖-DNA复合物并结合带负电荷的细胞膜，通过细胞内吞作用被细胞所吸收。脂质体法阳离子脂质富集DNA分子，形成稳定的DNA-脂质体并附着于带负电荷的细胞膜，脂质体与细胞膜发生融合，DNA被细胞所吸收。电穿孔法原理同电穿孔转化方法，但所用的参数不同。显微注射法转染方法人工合成的阳离子脂质Transfectam

的结构构建携带目的基因的表达载体表达载体被细胞吸收到细胞质中表达载体转移到细胞核中目的基因及选择性标记整合到基因组DNA中目的基因在真核细胞中的表达暂态表达稳定表达转染暂态表达(Transientexpression)

表达载体转染动物细胞后，表达载体以附加体(episome)形式存在于细胞核中。表达载体上的目的基因在24

-

72小时内表达，并随着附加体的消失而最终消失。稳定表达(Stableexpression)

用选择培养基筛选转染的动物细胞而获得稳定细胞系，表达载体上的目的基因整合到细胞的基因组DNA中。稳定细胞系可以持续表达目的基因。病毒载体介导的基因治疗过程利用病毒载体将目的基因导入靶细胞，使目的基因的产物补偿或替代有缺陷基因的功能。造血细胞、淋巴细胞、肝细胞、血管内皮细胞、皮肤成纤维细胞等可作为靶细胞限制性内切酶和修饰酶(Restrictionendonucleases

andmodifyingenzymes)一类存在于细菌中的核酸内切酶，它们识别双链DNA分子上特异的核苷酸序列，并对DNA分子进行剪切。限制性：细菌的DNA甲基化酶可对限制性内切酶识别序列中的碱基进行甲基化修饰，因此，细菌DNA不被限制性内切酶剪切，而外源DNA分子被限制性内切酶所剪切。内切酶：是指酶切位点在DNA分子内，而不是两端。限制性内切酶(一)限制性内切酶的分类回文结构

(palindrome)是双链DNA分子中的反向重复结构，即每条链从5’

3’方向读其核苷酸序列都相同。

5’GGATCC3’ 3’CCTAGG5’ 5’AGATCT3’ 3’TCTAGA5’ 5’CCCGGG3’ 3’GGGCCC5’1.命名属名(genus)的第一个字母，用大写表示；种名(species)的前两个字母，用小写表示；细菌株名(strain)，用大写或小写表示；同一细菌株中不同的限制性内切酶被发现和分离的顺序，用罗马字表示。(二)类型II限制性内切酶EcoRIE=Escherichia属co=coli种R=RY13株I=第1个被分离的限制性内切酶2.识别序列(1)

具有回文结构

BamHI 5’GGATCC3’ 3’CCTAGG5’

KpnI 5’GGTACC3’ 3’CCATGG5’(2)

具有间断的回文结构

HinfI(XmnI) 5’GANTC3’ 3’CTNAG5’(3)

具有简并性碱基

HincII 5’GT(T/C)(A/G)AC3’ 3’CA(A/G)(T/C)TG5’(4)

无回文结构

MboII 5’GAAGA(N)83’ 3’CTTCT(N)75’酶切位点识别序列(回文结构)DNA片段1DNA片段23.经限制性内切酶酶切后所产生的末端类型(1)粘性末端(stickyends,cohesiveends)5’凸端粘性末端EcoRI3’凸端粘性末端(2)平端或钝端(bluntends)异源同工酶(Isoschizomer)

来源于不同细菌但具有相同识别序列的限制性内切酶为异源同工酶。识别序列和酶切位点均相同的限制性内切酶

识别序列相同但酶切位点不同的限制性内切酶酶活性单位 在37

C(某些限制性内切酶在

25

C或50

C)条件下，每小时酶切1

gDNA所用的酶量为１个单位(Unit)。限制性内切酶缓冲液

NaCl,KCl:提供正确的离子强度

Tris-HCl:提供合适的pH环境

Mg2+:限制性内切酶的辅助因子

DTT:还原剂

BSA:保护限制性内切酶5.类型II限制性内切酶的反应条件T4DNA连接酶(T4

DNAligase)碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase)DNA聚合酶I大片段

(Klenow)T4DNA聚合酶(T4DNApolymerase)T7DNA聚合酶(T7DNApolymerase)TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)逆转录酶(Reversetranscriptase)末端脱氧多核苷酸转移酶(Terminaldeoxynucleotidyl

transferase)多核苷酸激酶(Polynucleotidekinase)DNA核酸酶I(DNAnucleaseI)S1核酸酶(S1nuclease)外切核酸酶III(ExonucleaseIII)

外切核酸酶(Exonuclease)修饰酶核酸的制备(PreparationofNucleicAcids)核酸的制备基因组DNA的制备总RNA的制备质粒DNA的制备苯酚及氯仿可使蛋白质变性，用于纯化核酸。用Tris-HCl(pH8.0)饱和酚去除DNA溶液中的蛋白质；用Tris-HCl(pH6.7)饱和酚去除RNA溶液中的蛋白质酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1

酚:氯仿＝1:1核酸的分离与纯化盐离子可中和核酸分子上的磷酸根；

2.5倍体积的乙醇或0.9-1倍体积的异丙醇使核酸沉淀；在12000xg离心力作用下，促进核酸沉淀。核酸的浓缩用于沉淀核酸的盐溶液注：需用70％乙醇洗涤核酸沉淀以除去盐离子。盐类储存液(M)终浓度(M)醋酸钠3.00.3醋酸铵10.02.0-2.5氯化锂8.00.8氯化钠5.00.2

建立基因组文库；

克隆特定的基因；

用Southern印迹检测某一基因的存在和拷贝数；

用PCR反应检测基因的存在及突变等；

进行DNA指纹分析从细胞或组织中提取的基因组DNA的目的：基因组DNA

的制备(1)细胞裂解蛋白酶K和SDS可破坏细胞膜及细胞中的蛋白质，使基因组DNA从破碎的细胞中释放出来。(2)蛋白质淬取用酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)淬取蛋白质。(3)基因组DNA沉淀用0.1倍体积的3MNaAC

和2.5倍体积的100%乙醇沉淀DNA,用

70%乙醇除去DNA沉淀中的盐离子。(4)将基因组DNA溶解在TE缓冲液中，使其终浓度为~1mg/ml，置4

C保存。基因组DNA的制备方法哺乳动物基因组DNA1,6.DNA/HindIII;2,3.大鼠基因组DNA；4,5.小鼠基因组DNA基因组DNA的检测细菌基因组DNA1.1KbPlusDNALadder;2,3.M.sm

基因组DNA123123456高纯度DNA：OD260/OD280>1.7

纯化mRNA；

建立cDNA文库；

克隆特定的cDNA；

用Northern印迹方法检测某一特定基因的表达；

用RT-PCR方法检测某一特定基因的表达。从组织或细胞中提取总RNA的目的：总RNA

的制备异硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸钠为强烈的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，使总RNA从细胞中释放出来。异硫氰酸胍法制备总RNA用TRIzol

试剂(Invitrogen

公司)处理细胞或匀浆组织氯仿萃取蛋白质沉淀RNA洗涤RNA沉淀用RNase-freeddH2O溶解RNA，并置-20

C保存

异硫氰酸胍和

-巯基乙醇等还原剂使内源性

RNase

变性失活,防止RNA被降解。

焦碳二乙酯(DEPC)使外源性

RNase

变性并失活。用0.1%DEPC配制缓冲液，然后高压灭菌除去DEPC。用0.1%DEPC处理EP管、Tip头。置玻璃器皿于180

C烤箱中烘烤４小时。

去除RNA酶(RNase)的方法

注意：DEPC是潜在的致癌剂，须小心操作。RNA的检测用琼脂糖凝胶电泳检测rRNA，确定总RNA的质量。物种rRNA大小(kb)人类18S1.928S5.0小鼠18S1.928S4.7果蝇18S2.228S2.8大肠杆菌16S1.523S2.9RNAMarkers(0.28-6.58kb);2.小鼠脑组织中的总RNA;3.大鼠脑组织中的总RNA123RNAMarkers(0.5-9.0kb);2.大肠杆菌总RNA18SrRNA28SrRNA16SrRNA23SrRNA1.5kb3.0kb6.58kb4.98kb121.90kb1