《缺血性脑卒中动物模型评价技术规范 第2部分：非人灵长类动物》（编制说明）

《缺血性脑卒中动物模型评价技术规范第2部分：非人灵长类动物》编制说明一、工作简况（一）任务来源缺血性脑卒中(cerebralischemicstroke,CIS)，指脑血循环障碍病因导致脑血管堵塞或严重狭窄，使脑血流灌注下降，进而缺血、缺氧导致脑血管供血区脑组织死亡。流行病学调查显示，CIS是我国排名第二的致死性疾病，年发病率约为247/10万人，死亡率约为115/10万人，未来随着人口结构的老龄化，我国CIS的发病率将持续升高，高致死和致残率将给社会和家庭造成严重负担，因此，近年来CIS已经成为重大慢性非传染性疾病研究的热点方向之一。非人灵长类脑结构与人类高度相似是开展脑疾病研究最理想的模式动物。非人灵长类构建的缺血性脑卒中动物模型在国内外已被广泛应用于CIS发病机制研究和药物评价，本标准基于广东省实验动物监测所参与国家重点领域研发“十三五”项目（急性局灶性脑缺血后全脑保护评估体系及转化研究）和主持“十四五”项目（基于非人灵长类的人类疾病动物模型创建及关键技术研究开展缺血性脑卒中动物模型制备技术研究基础上，结合模型应用的实践，本标准将依据经典的非人灵长类CIS模型制备方法，对缺血性脑卒中动物模型制备技术进行规范。（二）协作单位标准牵头单位为广东省实验动物监测所，协作单位中山大学附属第一医院、广西医科大学附属第一医院、深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心）。（三）主要工作过程1.起草阶段并结合具体临床应用的实际需求为主要参考依据，提出制定团体标准《缺血性脑卒中动物模型制备技术规范》的计划。本标准由广东省精准医学应用学会组织，广东省实验动物监测所牵头制定，其它单位参与，于2022年11月提交团体标准《缺血性脑卒中动物模型评价技术规范》的立项申请书，经学会秘书长审批通过后，于11月1日正式发布立项公告，并于同日在全国团体标准平台发布立项公示。立项公示后，起草工作组开展标准的编制工作并组织多次起草工作组的会议讨论。经过多轮研讨和修改，2023年6月在广东省精准医学应用学会主办的第三届华南疾病模型与临床研究论坛之疾病模型标准撰写与宣讲研讨会上，本标准起草工作组就标准初稿内容进行了汇报，并同与会专家进行了充分交流。经研究，起草工作组形成共识并提出以下建议：在同一标准项目下，优先分为《缺血性脑卒中动物模型评价技术规范第1部份：啮非人灵长类动物》两个部分来进行编制，2023年9月，《缺血性脑卒中动物模型制备技术规范第2部分：非人灵长类动物》开展了立项审查和发布工作。标准起草工作组于2024年9月完成了编写，上报学会标委会秘书处，于10月完成了对本标准内容的审核和格式重排，并启动发布征求意见公示工作。2.征求意见阶段2024年11月学会标委会秘书处将标准编制说明和征求意见稿通过全国团体标准平台发布公示，面向相关行业的单位和个人征求意见。截至到2023年12月，共收集到？条征求意见，经标准起草工作组讨论，采纳？条，不采纳？条。3.审查及报批阶段标准起草工作组将收集到的意见进行认真分析和处理，对征求意见稿进行最后修改，形成标准送审稿。由学会标委会秘书处组织技术审查。标准起草工作组根据审查意见修改整理后，最终形成标准草案报批稿，报广东省精准医学学会报批。（四）起草组成员及其工作主要起草人：李舸，关雅伦，范玉华，刘竞丽，黄忠强，张健，党超，叶子明，陈相任，刘尧，李韵峰，金毅，秦超，曾进胜，张钰。主要起草成员皆参与了本标准的研究、讨论和不同章节的编二、标准编制原则和确定标准主要内容（一）标准编制原则标准制定遵守国家和地方相关法律、法规、方针、政策，在广东省精准医学学会章程规定的业务范围内，符合精准医学相关技术标准制定范围，是学会疾病动物模型分会发展规划内容。2.公正性原则标准制定遵循开放、透明、公平、公正的原则，本着动物模型制备需要满足相似性、重复性、可依性、适用性和可控性、易行性和经济性的原则，吸纳医疗机构、检测机构、实验动物研究机构代表参团体标准制定。3.先进性原则按照有利于科学合理利用资源，有利于提高经济效益、社会效益、生态效益的原则，做到技术上先进、经济上合理，有利于精准医学行业发展。4.正确性原则标准编写依据国家重点领域研发结果，编写过程中，对技术方法、评价参数等内容进行核验，保证其正确性。通过使用精准的描写词汇、紧凑严密的语句结构来准确表达目的，力求让不同知识水平不同专业背景的人充分理解标准所述内容。5.简明性原则标准编写时注意标准内容简洁明了，力求让标准内容通俗易懂，并通过使用大众化语言使使用者在参照本标准时能够正确理解和执行。5.本标准规定了非人灵长类缺血性脑卒中模型制备的动物质量和饲养要求、制备方法、评价方法和结果判定。本标准适用于非人灵长类缺血性模型的制备及应用评价。（二）标准主要内容本标准由范围、规范性引用文件、术语和定义、动物质量和饲养要求、动物模型制备方法、评价方法和结果判定共7部分组成。主要技术内容如下。本标准规定了非人灵长类缺血性脑卒中模型制备的动物质量和饲养要求、制备方法、评价方法和结果判定。本标准适用于非人灵长类缺血性模型的制备及应用评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB14922.1实验动物寄生虫学等级及检测GB14922.2实验动物微生物学等级及监测GB/T14924.2实验动物配合饲料卫生标准GB14924.3实验动物配合饲料营养成分GB14925实验动物环境及设施T/CALAS104实验动物实验猴神经行为评价规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1缺血性脑卒中cerebralischemicstroke是指各种原因导致的脑组织血液供应障碍，并由此产生的缺血缺氧性坏死，进而出现神经功能障碍的一类临床综合征。3.2神经功能评价量表neurologicalfunctionassessmentscale用于评估动物模型神经功能缺损程度和恢复情况的工具，评价内容包括意识水平、感觉系统、运动系统和骨骼肌协调等。3.3运动能力评价motorfunctionassessment利用不同动物运动评价设备，如步态分析系统等，观察动物在不同情境下的运动行为变化，用于测试和评价动物的运动能3.4延迟记忆评价long-termmemoryassessment利用动物认知测试设备，如威斯康辛通用测试装置等，观察动物辨别物体能力以及对刺激信号的反应，用于测试和评价动物的工作记忆行为学变化。3.5核磁共振成像magneticResonanceImaging（MRI）利用原子核在磁场中产生的磁共振信号来生成动物组织器官内部结构变化的图像。4动物质量及饲养要求4.1非人灵长类质量应符合GB14922的要求。4.2饲养环境应符合GB14925的要求。4.3饲料应符合GB/T14924.2和GB14924.3的要求。5动物模型制备方法非人灵长类缺血性卒中模型制备方法通常包括电凝法、栓塞法和光化学法等。非人灵长类动物缺血性脑卒中模型构建的常用方法，手术操作简单。通过电凝器永久性阻断实验猴的大脑中动脉（MCA），造成脑缺血损伤。具体方法如下：进行麻醉、备皮、消毒等准备工作。2）麻醉。术前注射麻醉剂进行诱导麻醉，术中采用呼吸麻醉机进行维持麻醉，手术过程中保温。3）手术。非人灵长类动物侧放固定在手术台上，头固定于立体定位仪上。通过开颅手术暴露大脑中动脉（MCA）。使用电凝器对MCA进行电凝处理，阻断其血流，造成脑缺血损伤。电凝的位置和程度需要根据实验需求进行精确控制。动物苏醒后，放入饲养笼中进行护理。4）术后护理。术后动物比较虚弱，需注射抗生素3-5天，给予流质食物。必要时注射甘露醇降低颅内压，减少动物死亡。术后6小时后可通过MRI扫描确定脑梗死情况。5.2栓塞法非人灵长类动物缺血再灌注模型构建的常用方法。利用X射线成像设备或DSA的精确成像能力，结合微导管技术，将栓塞材料精准地送入目标血管（如大脑中动脉从而实现血管的闭塞。具体方法如下：1）术前准备。非人灵长类动物术前禁食12小时，自进行麻醉、备皮、消毒等准备工作。2）麻醉。术前注射麻醉剂进行诱导麻醉，术中采用呼吸麻醉机进行维持麻醉，手术过程中需保温。3）手术。非人灵长类动物仰卧固定在手术台上，通过X射线成像设备或DSA对脑血管进行造影检查，明确大脑中动脉的位置、形态及血流情况。根据动物血管大小选择合适的导管，在X射线成像设备或DSA的引导下，将微导管经股动脉穿刺置入，并引导至大脑中动脉的预定位置。通过微导管向大脑中动脉注入栓塞材料（如自体血栓凝块、弹簧圈、球囊等），观察成像图像以确认手术过程中去除部分颅瓣降低颅内压，减少动物死亡。4）术后护理。术后动物比较虚弱，需注射抗生素3-5天，给予流质食物。必要时注射甘露醇降低颅内压，减少动物死亡。术后6小时后可通过MRI扫描确定脑梗死情况。5.3光化学法非人灵长类缺血性脑卒中模型构建的常用方法，创伤面小，可精准定位。利用光敏剂（如玫瑰红）在特定强度光照下发生光化学反应，在大脑的照射局部产生脑水肿和血小板微血栓，进而形成局灶性脑梗死。具体方法如下：1）术前准备。非人灵长类动物术前禁食12小时，自进行麻醉、备皮、消毒等准备工作。2）麻醉。术前注射麻醉剂进行诱导麻醉，术中采用呼吸麻醉机进行维持麻醉，手术过程中需保温。3）手术。选定大脑中动脉远端或其他需要模拟卒中的脑区作为照射部位，插入光纤，静脉注射玫瑰红（35mg/KG）3分钟，使用激光（15mW）光源对选定的部位进行连续照射30分钟，移去光源，缝合骨膜、皮肤。必要时注射甘露醇降低颅内压，减少动物死亡。术后6小时后可通过MRI扫描确定脑梗死情况。6评价方法6.1脑损伤磁共振扫描评价6.1.1非人灵长类脑缺血性卒中模型可分为4期，超急性期（0-6小时），急性期（6-72小时），亚急性期（3-10天），慢性期（10天以后）。6.1.2检测检测脑水肿变化可采用弥散加权成像（Diffusionweightedimaging，DWI）。T2WI）。6.1.4脑梗死体积测定采用磁共振扫描获得T2WI图像，在每个脑冠状切片上圈选出脑梗死灶边界及对侧正常半脑边界，利用ImageJ软件计算梗死面积，将所有切面梗死灶面积和对侧正常半脑面积相加后乘以切片厚度，得到梗死灶体积及对侧正常半脑体积。脑梗死体积比（%）=（患侧半脑梗死组织体积÷对侧正常6.2神经功能评价参照T/CALAS104中6.1和7.1进行。6.3运动功能评价6.3.1利用步态分析设备评价动物四肢行走及协调能力。实验应在独立安静的环境中开展，测试前动物需禁食。造模前对动物进行训练，确保动物在匀速运动的跑步机上正常行走。造模后动物可以正常饮食和运动后，连续3天对动物进行步态视频录制，录制时长不少于10s。利用运动轨迹分析软件，对录制视频中动物各个标记关节进行分析，获得动物行走过程中的步频、步幅、步长、步间隔等数据，评价动物的运动功能。6.4延迟记忆评价参照T/CALAS104中6.2和7.2进行。6.5组织病理诊断动物安乐死后，对脑组织进行灌注固定，分离脑组织，在4%多聚甲醛中进行固定保存，经梯度酒精脱水、二甲苯透明后进行石蜡包埋制成蜡块，切成4μm厚度切片，进行苏木素-伊红或尼氏染色并封片。组织切片应包含梗死灶及周边半暗带组织，观察梗死灶和半暗带组织神经元坏死及炎症细胞活化情况。7.1磁共振成像病变特征1)超急性期在梗死区域DWI可显示明显的高信号，病变区表现为脑回部肿胀、脑沟部变浅、灰白质界限不清晰。2)急性期T1WI呈低信号、T2WI呈高信号、DWI高信号，脑室由于受压会出现变形、移位，中线结构向对侧移位，表现为局部的脑沟和脑裂消失。3)亚急性期表现T1WI低信号、T2WI高信号、梗死区DWI低信号。增强扫描可出现脑回状强化，显影逐渐变淡。4)慢性期病灶逐渐液化，周边胶质增生带呈高信号、DWI呈低信号。梗死区域局灶性脑萎缩，形成软化灶，类似于脑脊液的7.2脑梗死体积磁共振成像计算动物脑梗死体积比，评价造模后梗死体积大小。7.3神经功能神经功能评分由意识水平（0-28分感觉系统（0-22分运动系统（0-32分），骨骼肌协调性（0-18分）组成，总分越高表明神经功能损伤越严重。7.4运动功能7.4.1利用步态分析设备进行步态评价，连续3天评价的平均数作为实验结果，造模后的各肢体采集数据与造模前相比出现统计学上的显著性差异时可判定动物出现四肢行走及协调功能损伤。7.4.2利用山和谷阶梯任务装置开展运动感知行为评价，连续5天评价的平均分数作为实验结果，造模后的分数与造模前相比出现统计学上的显著性降低时可判定动物出现运动功能损伤。7.5延迟记忆利用威斯康辛通用测试装置开展延迟记忆评价，连续5天选择食盒的平均正确率作为实验结果，造模后的正确率与造模前相比出现统计学上的显著性降低时可判定出现记忆功能损伤。7.6组织病理动物处死后，病理诊断可见梗死灶内大量神经细胞坏死，神经元核固缩、胞浆呈嗜酸性，在半暗带区可见星形胶质细胞和小胶质细胞过度活化，胶质细胞胞体增大和大量聚集以及炎症细胞三、主要试验（或验证）的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果相关标准编制单位在国家重点研发计划“急性局灶性脑缺血后全脑保护评估体系及转化研究”期间，完成从啮齿类到非人灵长类的脑缺血模型构建，建立影像学、行为学的评价体系。项目的结题报告、相关的成果可体现的标准模型的可行性。1.MRI扫描出现典型脑梗死病变特征。磁共振结构和功能联合扫描是检测非人灵长类脑缺血动态变化的重要手段(Soulasetal.2023)，Pubmed检索显示该方法在18篇已发表的有关非人灵长类缺血性脑卒中模型论文中被应用，且70%的论文是在近10年发表的。我们使用光化学法构建的脑中动脉缺血性卒中模型，超急性期（0-6小时）动物脑病变不显著，T1WI在梗死灶位置呈现低信号，T2WI呈现高信号，在梗死灶及周边位置呈现低信号，T2WI则在大范围内呈现高信号，DWI在梗死灶区域呈现高信号；亚急性期（3-10天T1WI在梗死灶位置呈现低信号，T2WI呈现高信号，DWI在梗死灶区域仍保持高信号。慢性期（10天以后），病灶逐渐液化，T1WI信号不明显，T2WI在梗死灶位置呈现高信号，DWI在梗死灶区域信号降低（图1）。2.脑梗死体积测定。脑梗死体积主要基于磁共振T2W1图像扫描进行测定(Westetal.2009)，Pubmed检索显示该方法在25篇已发表的有关非人灵长类缺血性脑卒中模型论文中被应用。我们使用电凝法构建的脑缺血性组中模型，实验猴左侧半脑出现典型梗死灶（图2和表1）。造模后1个月和3个月脑梗死体积明显增加。表1开颅电凝法构建实验猴脑缺血模型梗死体积测定神经功能评价依据常用的非人灵长类神经功能评价量表开展(Kitoetal.2001)，Pubmed检索显示该方法在38篇已发表的有关非人灵长类缺血性脑卒中模型论文中被应用。我们使用电凝法构建的脑缺血性卒中模型，造模后1个月和3个月进行神经功能评分，造模后实验猴脑神经功能评分显著升高（图3）。图3电凝法构建实验猴脑缺血模型神经功能评价4.运动功能评价。步态分析常用于评价非人灵长类四肢运动能力和协调性(Liangetal.2023)，Pubmed检索显示该方法在12篇已发表的实验猴疾病模型相关论文中被应用。正常实验猴步态分析表明，动物四肢的步长、步幅和步频无明显差异（图4）。山和谷阶梯任务常用于评价非人灵长类脑缺血后上肢运动功能(MarshallandRidley2003)，Pubmed检索显示该方法在6篇已发表的实验猴缺血性脑卒中模型论文中被应用。我们使用电凝法构建的缺血性脑卒中模型，造模后1个月和3个月进行运动功能评价，实验猴右侧上肢无法完成山和谷阶梯任务，左侧上肢运动功能无异常，右侧上肢运动功能受损（图5）。图5电凝法构建实验猴脑缺血模型山和谷阶梯任务评价5.延迟记忆评价。威斯康辛通用测试装置（WGTA）常用于非人灵长类延迟记忆评价研究(TsujimotoandSawaguchi2002)，Pubmed检索显示该方法在34篇已发表的相关非人灵长类脑疾病模型论文中被应用。我们使用电凝法构建实验猴脑缺血脑卒中模型造模后1个月和3个月进行学习记忆功能评价，造模后实验猴脑学习记忆功能显著受损（图6）。图6电凝法构建实验猴脑缺血模型学习记忆功能评价6.组织病理诊断。组织病理诊断是评价非人灵长类脑缺血模型组织细胞变化的经典方法(CookandTymianski2012)。我们用光化学法诱导实验猴脑缺血性卒中模型，对梗死灶进行磁共振扫描并与脑组织大体解剖定位（图7A，7B红色圈为梗死）进行组织切片染色，HE染色结果显示，在局部脑缺血90天后，梗死灶形成液化性坏死，并被胶质细胞（以星胶细胞和小胶细胞为主）包裹（图7C梗死灶中可见大量坏死的神经元（图7D，红色箭头）和活化的胶质细胞（图7D，绿色箭头）。图7光化学法诱导实验猴脑缺血模型组织病理四、标准涉及的相关知识产权说明1.没有违反相关法律法规及强制性标准，目前暂无相关的国家标准、行业标准。2.参考的实验动物的饲养管理相关标准，与制定的团体标准不冲突。GB14922实验动物微生物、寄生虫学等级及检测GB/T14924.2实验动物配合饲料卫生标准GB14924.3实验动物配合饲料营养成分GB14925实验动物环境及设施T/CALAS104实验动物实验猴神经行为评价规范五、采用国际标准的程度与水平的简要说明目前，缺血性脑卒中造模和模型评价方法主要由国外实验室建立，我国在这方面的研究起步较晚，主要沿用国外文献报道的评价方法，且国内外尚未针对相关评价方法建立统一的标准。我们在前期研究中，建立缺血性脑卒中临床前多中心评价体系（广东省实验动物监测所，中山大学附属第一医院，广西医科大学附属第一医院，深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心通过构建非人灵长类动物脑卒中模型，并通过神经功能，梗死体积，学习记忆运动功能等方面进行评价，建立了多中心评价标准，并在多个团队进行测试，证明该方案渐变可行，完全满足评价要求，具有推广应用价值。六、重大意见分歧的处理经过和依据七、其他应予说明的事项Cook,D.J.&M.Tymianski(2012)Nonhumanprimatemodelsofstrokefortranslationalneuroprotectionresearch.Neurotherapeutics,9,371-9.Kito,G.,A.Nishimura,T.Susumu,R.Nagata,Y.Kuge,C.Yokota&K.Minematsu(2001)Experimentalthromboembolicstrokeincynomolgusmonkey.JNeurosciMethods,105,45-53.Liang,F.,S.Yu,S.Pang,X.Wang,J.Jie,F.Gao,Z.Song,B.Li,W.H.Liao&M.Yin(2023)Non-humanprimatemodelsandsystemsforgaitandneurophysiologicalanalysis.FrontNeurosci,17,1141567.Marshal