生物学基本技能 课件 ⅩⅢ 离心操作

生物学基本技能基本技能

ⅩⅢ离心操作目录Contents实验目的常用离心机类型常用离心管类型离心原理和技术参数离心机操作技术离心机的日常维护、常见故障及排除实验操作实训1.了解离心机的类型、结构原理及使用注意事项。2.掌握各种离心机的操作技术和技能。3.掌握离心机的一般维护和维修技能。一、实验目的二、常用离心机类型分类标准具体类型特点按离心机的转速低速离心机一般离心最大转速为3000～10000rpm，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红细胞、酵母菌等，广泛应用于生物化学、免疫学等领域，是实验室中离心沉淀的常用仪器高速离心机一般离心最大转速为10000～30000rpm，通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、免疫沉淀物等的分离纯化，广泛应用于生物与化学等科研、教学和生产部门超速离心机一般离心最大转速为30000～80000rpm，能使在电子显微镜下观察到的亚细胞分离分级，还可分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等按离心机的结构台式离心机又称为卧式离心机，主要用于悬浮液的固液分离，或将乳浊液中两种密度不同又互不相溶的液体分开落地式离心机又称为立式离心机，具有体积小、容量大等特点，其性能稳定、速度可调并能自动调节平衡，使用效率高，适用性广按离心机的分离方式过滤离心机工作原理主要是通过离心力，将混合液甩向转鼓壁，液体通过转鼓壁上的小孔及内部的滤网流出，而固体由于颗粒较大，被滤网截留沉降离心机通过固液体（或液液体）不同的比重差来进行分离。主要用于少量样品的分离按离心机的温度控制范围常温离心机常温低速离心机，在实验室常温下使用，转速可以达到5000rpm。常温高速离心机，在实验室常温下使用，转速可以达到12000rpm冷冻离心机分为低速冷冻离心机和高速冷冻离心机。前者转速一般不超过4000rpm；后者转速可达20000rpm以上，多用于收集微生物、细胞碎片、细胞、大的细胞器、硫酸沉淀物以及免疫沉淀物等（一）按离心管材质分类1）塑料离心管。塑料离心管常用的材料有聚乙烯（PE）、聚碳酸酯（PC）、聚丙烯（PP）等，其中聚丙烯管性能相对较好。塑料离心管的优点是硬度小，可用穿刺法取出样本；缺点是易变形、抗有机溶剂腐蚀性差、使用寿命短。2）玻璃离心管。使用玻璃离心管时离心力不宜过大，需要垫橡胶垫，防止管子破碎。高速离心机一般不选用玻璃离心管。玻璃离心管盖封闭性不够好，液体不能加满(针对高速离心机且使用角转子)，否则会使液体外溢，失去平衡。外溢后果是液体污染转子和离心腔，影响感应器正常工作。超速离心时，液体一定要加满离心管，因为超速离心需要抽高真空，只有加满才能避免离心管变形。3）金属离心管。金属离心管一般采用不锈钢材质。不锈钢离心管具有强度大、不变形、抗热、抗冻、抗化学腐蚀等优点。其主要用于工业生产，但同时要注意避免接触如强酸等腐蚀性的化学物质。三、常用离心管类型（二）按离心管底部形状分类1）锥形离心管。也称为尖底离心管，底部为锥形。当样品量少而需收集沉淀时，用锥形离心管更容易分离，上层液更容易用吸管吸取，是使用最多的离心管。2）平底离心管。用途和锥形离心管相同，但平底离心管可以立放，实验中更方便放取。3）圆底离心管。当进行密度梯度离心时，最佳选择是圆底离心管，圆底底面积大，较锥形底能承受更大的离心力。三、常用离心管类型三、常用离心管类型（三）按离心管容量分类1）微量离心管。微量离心管是一种小型的离心管，又称EP（eppendorf）管，常与微型离心机配套使用，用于微量试剂的分离。其常见容量规格有0.2mL、0.65mL、1.5mL、2mL。2）普通离心管。普通离心管是实验室最常见的离心管，常见的容量规格为15mL、30mL、50mL。3）大容量离心管。大容量离心管又称为离心瓶或离心杯，是大容量细胞收获、切粒和蛋白纯化的离心选择，常用于工业化生产。其常见的容量规格为250mL、500mL、600mL。三、常用离心管类型（四）按离心管盖闭合方式分类1）压盖离心管。以按压方式密封的离心管，常见于微型离心管，都属于压盖离心管。2）螺旋盖离心管。容量50mL以上的离心管以螺旋盖离心管为主。螺旋盖离心管又可分为平盖（盖子顶部是平的）和塞盖（盖子顶部有塞子形状）。三、常用离心管类型（一）基本概念1）离心力（centrifugalforce,Fc）。离心力是指由于物体旋转而产生脱离旋转中心的力，也指物体做圆周运动所产生的向心力的反作用力。当物体所受外力小于运动所需要的向心力时，物体将向远离圆心的方向运动，这种运动称为离心运动，也叫离心现象。离心运动是由向心力消失或不足导致的。在一定角速度下做圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力，离心作用是根据这一原理进行的。离心力（Fc）的大小等于离心加速度w2r与颗粒质量m的乘积。2）相对离心力（relativecentrifugalforce,RCF）。通常颗粒在离心过程中的离心力是相对于颗粒本身所受的重力而言，因此把这种离心力称为相对离心力，其单位是重力加速度“g”。由于各种离心机转子的半径或离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力也不同。四、离心原理和技术参数（一）基本概念3）沉降速度（sedimentationvelocity)。沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。4）沉降时间。在实际工作中，常常遇到在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来需要多大转速与多长时间的问题。如果转速已知，则需确定分离某粒子所需要的时间，即沉降时间。5）K系数。用来描述在一个转子中将粒子沉降下来的效率。K系数与离心转速及粒子沉降的路径有关，所以K系数是一个变数。6）沉降系数。沉降系数是指颗粒在单位离心场作用下的沉降速度，其单位为秒。各种生物样品的沉降系数差别很大，利用沉降系数的差异，可以应用离心技术来定性和定量地分析及分离制备。四、离心原理和技术参数（二）离心技术原理离心技术是指利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或悬浮密度的差异进行分离、浓缩和提纯生物样品的一种方法。1）差速离心技术原理。差速离心技术又称为分步离心技术，是利用不同颗粒在离心场中沉降系数的差异，在同一离心条件下，通过不断增加相对离心力，使不同沉降系数的粒子分离的离心方法。四、离心原理和技术参数（二）离心技术原理2）速率区带离心技术原理。速率区带离心技术是根据分离粒子的沉降系数不同，在某一离心力的作用下，使具有不同沉降速度的粒子在梯度液中处于不同的密度梯度层内，形成几条分开的样品区带，达到彼此分离的技术。四、离心原理和技术参数（二）离心技术原理3）等密度区带离心技术。采用等密度区带离心技术离心时，需要在离心前预先制备密度梯度液，包括被分离样品中所有粒子的密度。待分离的样品与梯度液先混合，离心开始后，梯度液由于离心力的作用逐渐形成一个从离心管底部到液面密度逐渐递减的连续密度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度，粒子上浮；当液面处粒子密度大于介质密度时，粒子沉降，最后粒子进入一个它本身的密度位置，即粒子密度等于介质密度，粒子形成纯组分区带。其特点是：形成的区带与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小及其他参数无关，只要转速、温度不变，即使延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。四、离心原理和技术参数（三）技术参数1）离心机的主要技术参数（1）最大转速：最大转速指离心机转头可达到的最大转速，单位是rpm或r/min。（2）最大离心力：最大离心力指离心机可产生的最大相对离心力，单位是g。（3）最大容量：最大容量指离心机一次可分离样品的最大体积，通常表示为m×n，m为一次可容纳的最多离心管数，n为一个离心管可容纳分离样品的最大体积，单位是mL或L。（4）调速范围（转速设置范围）：调速范围指离心机转头转速可调整的范围。（5）温度控制范围：温度控制范围指离心机工作时可控制的样品温度范围。（6）工作电压：工作电压一般指离心机电机工作所需要的电压。（7）电源功率：电源功率通常指离心机电机的额定功率。四、离心原理和技术参数（三）技术参数2）离心机转头的主要技术参数转头（rotor）是离心机分离样品的核心部件，它的转速与转子的材料及强度有关。低速离心机一般采用超硬铝合金；超速离心机采用钛合金。一般来说，同一类型离心机，重量轻、容量小的转头转速要高；反之，转速要低。离心机常有多种不同形状的转头，其各自所反映的离心力场的大小和沉降距离也不一样，在实际工作中应根据分离要求正确选择使用。四、离心原理和技术参数（三）技术参数2）离心机转头的主要技术参数离心机各类转头的名称与应用见右表。

四、离心原理和技术参数（一）低速离心机（low

speedcentrifuge）1）结构低速离心机的结构较为简单，由电动机、离心转盘（转头）、调速装置、定时器、离心套管与底座等主要部件构成。电动机是离心机的主要工作部件，一般多为串激式电动机，包括定子和转子两部分。离心转盘（转头）常用铸铝制成，是平顶锥形。电动机的调速装置有多种，如多抽头变阻器、瓷盘可变电阻器等形式。离心套管主要用塑料或不锈钢材料制成。五、离心机操作技术（一）低速离心机（low

speedcentrifuge）2）适用范围主要用于分离细胞、细胞碎片及培养基残渣等颗粒物，临床上主要用于血浆、血清的分离及脑脊液、胸腹水、尿液等有效成分的分离。3）操作步骤（1）离心前准备①将离心机放置在坚实的水平台面上，离心机调水平。②打开机盖。③根据需要规格安装好转子。④离心样品配平。将装有样品的离心管装入离心套管内放在天平上称量配平，将配平好的两组装有样品的离心套管对称放置于离心机转子的孔内。单份样品可取一支空离心管加水与之配平，并对称放置。五、离心机操作技术（一）低速离心机（low

speedcentrifuge）3）操作步骤（2）运转前检查①检查设备清洁合格并在有效期内，且未被再次污染，有“设备完好”标识。②检查设备完整性及转子的正常，确保转头安装到位，转动灵活，金属元件无腐蚀的痕迹，同时检查固定转头的锁母是否旋紧。③检查电源供电正常。④确保待分离样品与离心管、转头的化学相容性，确保离心管适用性及装液量符合要求。⑤确保样品等量配平，对称放置，严禁在未经配平的状态下运转。

五、离心机操作技术（一）低速离心机（low

speedcentrifuge）3）操作步骤（3）离心操作①定时器旋钮、速度旋钮均置于“0”位置，开启电源开关，指示灯发亮，电源即接通。②将定时器旋钮旋至所需离心时间的位置，若所需时间少于5min，应先旋转超过5min，再旋转回到所需定时位置。③缓慢调节速度旋钮至所需要的速度值。调节速度不要太快，以免电流突然增加过快而烧坏电机。④离心结束，等待转子停止转动后方可打开离心机上门，轻轻取出离心管样品。⑤关闭电源开关，离心机断电。五、离心机操作技术（一）低速离心机（low

speedcentrifuge）4）操作注意事项①离心管内所放样品的液面不许超过最大使用容量的刻度线，防止飞液。②安放离心机的台面应坚实、平整，所有离心机脚均应与台面接触和均匀受力，以免产生振动。③离心样品必须配平并对称放置。④离心机运转过程中严禁移动离心机，严禁打开离心机上门。⑤调节速度时不要太快，以免电流突然增加过快而烧坏电机。⑥若离心过程中出现离心机较大振动，立即停机处理。⑦电源必须接地线。

五、离心机操作技术（二）高速离心机（high

speedcentrifuge）1）结构高速离心机通常有转动装置、速度控制系统、真空系统、温度控制系统、离心室、离心转头及安全保护装置等。以下主要介绍转动装置、速度控制系统、真空系统、温度控制系统及安全保护装置。（1）转动装置：转动装置主要由电动机、转头轴以及它们之间的连接部分构成。（2）速度控制系统：速度控制系统由标准电压、速度调节器、电流调节器、功率放大器、电动机及速度传感器等部分构成。（3）真空系统：当转速超过40000rpm时，空气的摩擦生热就会产生严重后果。因此，高速离心机一般配有真空系统，将离心腔密封并抽成真空，以克服空气的摩擦生热，保证离心机达到所需要的转速。（4）温度控制系统：温度控制系统由压缩机、冷凝器、毛细管和蒸发器四个部分组成，采用全封闭式制冷压缩机。（5）安全保护装置：安全保护装置包括电源过电流保护装置、驱动回路超速保护、冷冻机超负荷保护和操作安全保护四个部分。五、离心机操作技术（二）高速离心机（high

speedcentrifuge）2）适用范围主要用于细菌的蛋白沉淀、核酸提取，细胞或亚细胞组分分离，动、植物病毒分离，血液血清提取及溶液中大小颗粒不同组分的分离等。3）操作步骤（1）离心前准备①将仪器安装在坚实水平的地面上，距墙壁的距离大于10cm，以确保制冷系统散热良好。②离心样品配平。将装有样品的离心管装入离心套管内，放在天平上称量配平，将配平好的两组装有样品的离心套管对称放置于离心机转子的孔内。单份样品可取一支空离心管加水与之配平，并对称放置。③根据需要规格安装好转子。

五、离心机操作技术（二）高速离心机（high

speedcentrifuge）（2）运转前检查①检查设备清洁合格并在有效期内，且未被再次污染，有“设备完好”标识。②检查设备完整性及转子的正常，确保转头安装到位，转动灵活，金属元件无腐蚀的痕迹，同时检查固定转头的锁母是否旋紧。③检查电源供电正常。④确保待分离样品与离心管、转头的化学相容性，确保离心管适用性及装液量符合要求。⑤确保样品等量配平，对称放置，严禁在不平衡的状态下运转。⑥室内应干燥，通风良好，相对湿度保持在85%以下，室内温度最好在25～35℃之间。

五、离心机操作技术（二）高速离心机（high

speedcentrifuge）（3）离心操作①样品放置好后，关上门盖，使门盖锁紧。②开启电源开关，指示灯发亮，电源即接通。③设置转子号。在停止状态下时，设置转子号、转速、温度、时间，按设置键（SET键），此时离心机处于设置状态。停止灯亮，运行灯闪烁，当转子数码管右下角的小数点灯亮时，即进入转子号设置，再按“▲”或“▼”键选择离心机本次工作所用的转子号。④设置转速。按设置键（SET键），当转速最后一个数码管右下角的小数灯亮时，即进入转速设置，再按“▲”或“▼”键选择离心机本次工作所用的转速。⑤设置温度。按设置键（SET键），当温度最后一个数码管右下角的小数灯亮时，即进入温度设置，再按“▲”或“▼”键确定离心机本次工作所用的温度。

五、离心机操作技术（二）高速离心机（high

speedcentrifuge）（3）离心操作⑥设置时间。按设置键（SET键），当时间最后一个数码管右下角的小数灯亮时，即进入时间设置，再按“▲”或“▼”键选择离心机本次工作所用的时间，时间为倒计时。⑦在运行过程中，如果要看离心力，按下“RCF”键，即显示当时转速下的离心力，3s后自动返回到运行状态。⑧离心机时间倒计时到“0”时，电机断电，5s后开始刹车，离心机将自动停止。当转速显示为“0rpm”时，转子停止转动后方可打开离心机上门，轻轻取出离心管样品即可。⑨关闭电源开关，离心机断电。五、离心机操作技术（二）高速离心机（high

speedcentrifuge）4）操作注意事项①离心机运转过程中严禁移动离心机，严禁打开离心机机盖。②安放离心机的地面应坚实、平整，所有离心机脚均应与地面接触和均匀受力，以免产生振动。③离心样品必须配平并对称放置。④每次停机后再开机的时间间隔不得少于5min，以免压缩机堵转而损坏。⑤每次离心完成后，必须取出转子。⑥若离心过程中出现离心机较大振动，立即停机处理。⑦电源必须连接地线。⑧所有转子不能超过其最高转速使用。五、离心机操作技术（三）超速离心机（ultracentrifuge）1）结构超速离心机主要由驱动装置、速度控制系统、温度控制系统（由安装在转头下面的红外线测量感受器直接并连续检测离心腔的温度，以保证更准确更灵敏的温度调控）、真空系统、转头及安全保护装置组成。五、离心机操作技术（三）超速离心机（ultracentrifuge）2）适用范围超速离心机按用途分为制备型、分析型及分析制备型三种。制备型超速离心机主要用于生物大分子、细胞器和病毒的分离纯化，能使亚细胞分级分离，并可用于测定蛋白质及核酸的分子量。分析型超速离心机装有光学系统，可拍照、测量、数字输出，有自动打印系统等，可通过光学系统对测试样品的沉降过程及纯度进行观察。分析制备型超速离心机将分析型和制备型超速离心机的优点结合在一起，使得设备更完美。3）操作步骤（1）打开电源：若离心机门未开启，需推把手开启离心机盖，不可强行开启。（2）样品平衡：将样品倒入离心管后连同挂篮和盖子一起使用天平称重，在0.02g的误差范围内才能放入转头的对应孔内。6个挂篮必须同时使用，若样品管为奇数管可用蒸馏水作平衡管。具体转头信息和对应离心管信息应查阅相应说明书，并严格按照说明书要求操作。五、离心机操作技术（三）超速离心机（ultracentrifuge）3）操作步骤（3）放置转头：6个挂篮放入转头对应的孔内，然后将转头置入离心槽，此时一定注意转头中心内孔应该卡定在离心机转子的正确位置上。轻轻转动转头，显示屏转速栏有读数，说明速度检测装置正常，否则说明仪器异常，立刻联系仪器负责人（一定要锁紧挂篮盖子和装好挂篮，否则在超速离心过程中转头容易脱离转子而产生极大的安全隐患）。（4）关闭离心机盖：一定要轻轻、缓慢地关上。（5）设定离心参数：离心参数包括离心转速、时间、温度。（6）开始离心：按START键开始离心，并抽真空，当真空度达到200Pa以下，离心机才能够提升转速超过3000rpm，最终离心机平稳运行时的真空度应为20Pa。（7）停止离心：时间一到自动停止，遇紧急情况可按STOP随时停止。

五、离心机操作技术（三）超速离心机（ultracentrifuge）3）操作步骤（8）解除真空：按真空按钮，解除真空。（9）取出转头：推把手开启离心机盖，取出转头放在对应的底座上。（10）关闭主机电源。（11）填写仪器使用及维护记录单（簿）。五、离心机操作技术（三）超速离心机（ultracentrifuge）4）操作注意事项（1）对称放置的离心杯必须经过配平。（2）必须保证离心机的前后和左右分别水平。（3）严禁使用有裂纹、腐蚀斑点、漏液的离心杯。（4）用完后要即时除去腔室中的冰霜与湿气。如需要继续使用，应及时关闭设备上盖，减少冰霜的凝结。（5）离心机运行产生较大振动时，应立即停机检查。（6）机器运转中如发现有任何不正常的振动、噪声和气味应立即停机，切断电源，然后进行检查。如有解决不了的问题，应及时与技术人员联系。（7）本设备要使用三线或五线电线和插头接地线。（8）使用前、后检查离心机腔体是否有样品和灰尘的堆积，若有要立即进行清理。

五、离心机操作技术（四）管式离心机（tubularcentrifuge）1）外形结构为了减小离心机转鼓所承受的应力，使物质有足够的沉降时间，把离心机的转鼓（相当于离心管）直径变小，长度加长，类似一根长管子，故称管式离心机。结构包括主轴、压紧轮、电机、机身、进液部分、转鼓和集液盘等。

五、离心机操作技术（四）管式离心机（tubularcentrifuge）管式离心机的主要技术参数见下表。

五、离心机操作技术（四）管式离心机（tubularcentrifuge）2）适用范围管式离心机是利用离心力来达到液体与固体颗粒、液体与液体的混合物中各组分分离的机械设备。管式分离机是目前使用离心法进行分离的理想设备，主要用于液-固、液-液或液-液-固三相分离，其最小分离颗粒为1μm。特别是对一些液固相比重差异小，固体粒径细、含量低，介质腐蚀性强等物料的提取、浓缩、澄清较为适用。与其他分离机器相比，可以得到高纯度的液相和含湿量较低的固相，而且具有连续运转、自动控制、操作安全可靠、节省人力和占地面积小、减轻劳动强度和改善劳动条件等优点，已广泛应用在生物医学、中药制剂、保健食品、饮料、化工等行业。

五、离心机操作技术（四）管式离心机（tubularcentrifuge）3）操作步骤（1）操作前的准备（2）开机操作：①启动机器（电源连接无误后）。②待机器全速运转无误后，方可打开进料阀门，先将阀门开小，待液体从集液盘流出后，将阀门开启到预定的位置。③分离操作中，一般情况下，不要中间停止进行加料。（3）停机：停机前必须先关掉进料阀门，等到集液盘不流出液体时，方能关机。（4）排渣及清洗转鼓（5）转鼓的装配五、离心机操作技术（五）三足离心机（three

columncentrifuge）1）结构又称为三足式离心机，因底部支撑为三个柱脚，以等分三角形的方式排列而得名，是一种固液分离设备。五、离心机操作技术（五）三足离心机（three

columncentrifuge）2）适用范围主要分为过滤式和沉降式两种分离形式。（1）过滤式：转鼓开孔，附加过滤介质通过拦截的方式做到固液二相分离的离心机统称为过滤式离心机。过滤式离心机适用于物料黏度小、固相颗粒不易变形（如结晶体）且较大的小批量生产，多用于工业脱水。（2）沉降式：沉降式离心机设备转鼓为密闭桶状，该设备工作原理是通过离心力做到固液二相分离，这种形式的离心机统称为沉降式离心机。沉降式离心机适用物料广泛，黏度大，固相颗粒小的物料都能通过提高离心力的方式来达到固液二相分离的要求。

五、离心机操作技术（五）三足离心机（three

columncentrifuge）3）操作步骤（1）填料：物料通过水平的填料管被填入旋转离心鼓。填料的同时母液被甩离离心鼓并形成滤饼，通过填料控制可以进行多次填料以达到最佳滤饼厚度。填料过程可以在低速条件下进行，以保证最初滤饼形成，且减少漏料。（2）初步甩干：一般在填料后需要将母液尽快甩离离心鼓。离心鼓的转速自动调节至由操作人员设置的速度（较高速度），这也是初步甩干步骤。（3）洗涤：当母液被甩离滤饼后，滤饼通常需要用一种或者多种洗涤液进行洗涤。在洗涤过程中要降低离心机转速，以增加洗涤液与滤饼的接触时间。（4）甩干：洗涤后，将离心鼓转速提到最高，将滤饼甩干。（5）下料：将离心鼓转速调至下料转速，离心鼓的水平平动部分被逐渐推出，滤饼被自动卸出离心鼓。下料后表示一个周期结束，离心鼓的水平平动部分被推回离心鼓，恢复原始位置，开始新的周期。

五、离心机操作技术（一）离心机的