固态发酵技术及过程控制

2024/11/5801第四章固态发酵技术及过程控制第一节概述

第二节固态发酵过程的控制

第三节固态发酵技术

2024/11/5280第一节概述一、固态发酵的定义

一切使用不溶性固体基质来培养微生物的工艺过程，称为固体基质发酵（solidsubstratefermentation）

固体悬浮在液体中的深层发酵固态发酵

没有（或几乎没有）游离水的湿固体材料上培养微生物的工艺过程。2024/11/5380固态发酵的定义是指没有或几乎没有自由水存在下，在有一定湿度的水不溶性固态基质中，用一种或多种微生物的一个生物反应过程，因此固态发酵是以气相为连续相的生物反应过程。2024/11/5480二、固态发酵的特点1、固态发酵培养基中没有游离水的流动，水是培养基中较低的组分。培养基中水活度在0.99以下，适宜于水活度在0.93～0.98的微生物生长，限制了应用范围，同时也限制了某些杂菌的生长。2、微生物从湿的固态基质吸收营养物，营养物浓度存在梯度，发酵不均匀，菌体的生长、对营养物的吸收和代谢产物的分泌存在不均匀。2024/11/55803、固态发酵中培养基提供的与气体的接触面积要比液体深层发酵中与气泡的接触面积大得多，供氧更充足，同时，空气通过固体层得阻力较小，能量消耗低。4、使用固体原料，在发酵过程中，糖化和发酵过程同时进行，简化操作工序，节约能耗。5、高底物浓度可以产生高的产物浓度。6、由于产物浓度高，提取工艺简单可控，没有大量有机废液产生，但提取物含有底物成分。7、生产机械化程度较低，缺乏在线传感仪器，过程控制较困难。2024/11/5680三、固态发酵的分类1、自然富集固态发酵2、强化微生物混合固态发酵3、限定微生物混合固态发酵4、单菌固态纯种发酵2024/11/5780自然富集固态发酵是指利用自然界中微生物，由不断演替的微生物进行的富集混合发酵过程。例如传统的酒曲、酱油和堆肥发酵等，不需要接种微生物，而是依赖空气和物料中的自然微生物区系，由多种微生物演替成最适于生长代谢或共同协作的小生态环境。2024/11/58802、强化微生物混合固态发酵是指在自然富集固态发酵的基础上，根据人们部分掌握的微生物代谢机制，强化接种微生物菌系不明确的富集培养物或特定微生物培养物所进行的混合发酵，例如沼气发酵、白酒发酵及废物发酵降解处理等。2024/11/59803、限定微生物混合固态发酵是在对微生物相互作用和群落认识的基础上，接种混合培养的微生物是已知和确定的，通常使用两种或两种以上经过分离纯化的微生物纯种，同时或先后接种在灭菌的培养基中，在无污染条件下进行的固态发酵过程。2024/11/510804、单菌固态纯种发酵是在纯种培养基础上建立起来的，采用已知的单一微生物菌种，接种在灭菌的固态培养基中，在无菌条件下进行的固态发酵过程。它对于扩大固态发酵的应用范围和潜力的发挥起到非常重要的作用，是固态发酵的重要方向。2024/11/51180四、固态发酵反应器1、静态固态发酵反应器塔柱式（图4-1）2024/11/51280浅盘式（图4-2）

1－浅盘室；2－水阀门；3－紫外灯管；4，8，13－空气阀门；5，11－空气过滤器；6－排气口；7－加湿器；9－加热器；10－空气循环；12－进气口；14－浅盘；15－浅盘架2024/11/51380园盘固体发酵机2024/11/51480强制通风物料静态反应器（图4-3）1－发酵罐；2－空气调节阀门；3－空气温度传感器；4－湿度传感器；5－排气阀；6－温度控制；7－加湿器；8－冷却盘管；9－加热器；LP－液面探针；RH－相对湿度调节器2024/11/51580

图4－4强制通风填充床反应器2024/11/51680图4－5Koji工业制曲设备

1－曲室；2多孔板；3－旋转机；4，11－卸料螺杆机；5－空气调节器；6－鼓风机；7－排气管；8－调节阀；9－空气过滤器；10－装料机；12－控制台

2024/11/517802、动态固态发酵反应器

（1）转鼓式

2024/11/51880（2）带机械搅拌的筒柱式

图4－7搅拌式固态发酵反应器

1－搅拌架电机；2－搅拌桨电机；3－接种和喷水口；4－温度传感器；5－测重仪；6－湿度传感器；7－冷却器；8－湿度调节器；9－空气流量器；10－鼓风机；11－加热器；12－空气过滤器；13－空气冷却器2024/11/51980滚筒发酵机2024/11/52080（3）流化床反应器2024/11/52180粉剂硫化床2024/11/52280（4）塔式反应器2024/11/52380脱氯塔2024/11/52480一酸塔2024/11/52580五、固态发酵发展趋势和应用前景

固态发酵可利用多种工农业残渣作为底物大量生产化学物质，在有机酸、酒精、单细胞蛋白、蘑菇、酶制剂、生物活性物质及风味物质等，尽管上述研究有的还处在实验室研究阶段，但固态发酵被认为是可再生性资源综合利用最有希望的途径，是解决当前人类所面临的“三大”危机的一个有效手段。当前，许多工农业残渣、城市生活垃圾已成为人们的社会公害，对人类的生存环境均产生不利的影响。2024/11/52680第二节固态发酵过程的控制一、固态发酵微生物及生长机制

1、适合固态发酵微生物特征

①能够利用多糖的混合物；②有完整的酶系，可以迅速从对某一种多糖的代谢转为对另一种多糖的代谢；③能够深入到料层中，也能穿入基质细胞内；④在发酵过程中以菌丝形式生长，而不易孢子化；⑤生长迅速，染菌概率小；⑥可以在含水量低的基质中生长；⑦能够耐受高浓度的营养盐；⑧可以耐受基质预处理过程中产生的苯类等有毒物质。2024/11/527802、界面作用（1）营养物在界面上的富集（2）界面分布的微生物（3）微生物界面效应的意义2024/11/528803、固态基质中丝状微生物的生长丝状真菌的生长是以其顶端延长的方式进行的，顶端之后的菌丝只能变厚而不能伸长；在生长过程中又靠顶端延伸的方式产生繁茂的分枝而构成真菌的菌落，可见真菌的生长主要表现在菌丝顶端的生长。外层是不定形的组分，主要是蛋白质、甘露聚糖和葡聚糖；内层是定形的，由几丁质、纤维素或二者组成的微纤。顶部后面坚硬的细胞壁和复杂的分支系统使得菌丝牢固地固定在底物上，并产生强大的内压使顶部延伸有了动力。2024/11/529804、固态基质中细菌和酵母菌的生长自然沤肥：湿润的有机物被一系列微生物所分解，其中，由于嗜热芽孢杆菌的代谢活动，在木质纤维素类物质的分解过程中，会产生大量的代谢热，导致培养基内温度高达60℃以上。饲料的青贮：是由细菌参与的自然固态发酵过程，尤其是在发酵过程的后期，随着发酵过程的进行，体系的pH值降低，同时培养基内局部的氧被耗尽，造成培养基内变成厌氧环境，从而抑制了真菌的生长。2024/11/53080纳豆：是日本的一种风味食品，它主要是由枯草芽孢杆菌发酵蒸煮过的大豆而制成。在严格无菌条件下，细菌被越来越多地用于固态发酵过程，如利用芽孢杆菌(Bacillusspp．)发酵麸皮生产淀粉酶等。2024/11/53180利用酵母菌的纯种固态发酵果皮及其他废弃物产酒精，也愈来愈引起人们的重视。在淀粉类物质为底物的同步糖化发酵过程中，淀粉酶和酵母菌被同时引入固态发酵系统，酵母菌的存在还有利于提高发酵产品中的蛋白质含量。2024/11/53280二、固态发酵基质原料玉米秸秆、玉米芯、小麦秸秆、水稻秸秆、麸皮、稻壳、玉米、大米、小米、大豆、甘蔗渣、酒糟、木薯、玉米皮渣等。为了使底物更容易被微生物利用，经常对底物进行化学或机械物理处理，如采用酸、碱进行化学水解处理或采用爆碎、粉碎、研磨等物理处理。2024/11/53380固体发酵基质原料

影响微生物生长的因素（1）固体基质的大分子结构（2）颗粒大小影响微生物的生长（3）颗粒形状（4）颗粒的多孔性（5）颗粒均匀性及硬度2024/11/53480固态发酵基质的差异性（1）复杂的，非均一的基质结构。（2）基质的不同批次之间的差异。（3）发酵基质混合上的困难。（4）微生物在基质颗粒间活力的不均匀性。2024/11/53580三、影响固态发酵过程的主要参数1、湿度与水活度2、温度与热量传递3、通气与传质过程4、pH值2024/11/53680第三节固态发酵技术一、混合固态发酵技术（一）混合固态发酵概念混合发酵(mixedfermentation)：许多发酵过程是纯菌株无法完成或只能微弱地进行的，必须依靠两种或多种微生物共同培养来完成的过程如传统酒曲和酱曲、腌菜、烟草发酵、茶叶发酵、青贮、堆肥等。2024/11/53780强化微生物混合固态发酵(intensifiedmixedsolid-statefermentation)

以人为强化接种微生物菌系不明确的富集培养物或特定微生物培养物来进行混合发酵如传统酒曲和酱曲、腌菜、烟草发酵、茶叶发酵、青贮、堆肥等。2024/11/53880（二）混合固态发酵工艺特点1、充分利用培养基、设备、人员和时间，可以在同一发酵容器中经过相同工艺过程，提高所需产品的质和量，或获得良种、多种产品。2、混合发酵能够获得一些独特的产品，而纯种发酵是很难做到的。3、混合的多种菌种，增加了发酵中许多基因的功能，通过不同代谢能力的组合，完成单个菌种难以完成的复杂代谢作用，可以代替某些基因重组工程菌来进行复杂的多种代谢反应，或促进生长代谢，提高生产效率。2024/11/53980混合的多种菌种例如，华根霉（Rhizopuschinensis）可发酵生产延胡索酸。当它与大肠埃希菌（E．coli）混合发酵，延胡索酸就能完全转化成琥珀酸。用膜醭毕赤酵母（Pichiamembranaefaciens）代替大肠杆菌混合发酵，延胡索酸就被转化为L—苹果酸。如果普通变形菌（Proteusvulgaris）和少根根霉（R．arrhizus）混合发酵，则可将延胡索酸转化为天冬氨酸。2024/11/54080（三）混合固态发酵过程控制1、发酵微生物的选择与培养在限定微生物混合固态发酵中，用两种或两种以上经鉴定的纯种微生物进行发酵。这种条件下，微生物的营养需求已知，就可以建立适合于这些微生物生长发育的培养条件。2、发酵过程条件控制好氧发酵厌氧发酵交替进行2024/11/54180（四）混合固态发酵工艺过程存在的问题1、大多数混合菌体系中菌间相互关系和作用机制的研究尚不够深入；2、对于具有协同作用关系的菌株筛选和组合还是一个随机的过程，缺乏有效的理论指导，；3、对混合培养体系也不能有效地协调菌间的关系，使其达最佳生态水平，发挥最大效应。2024/11/54280二、静态密闭式固态发酵技术静态密闭式固态发酵，主要是指发酵过程中的固体基质保持相对静止状态，通常所说传统的固态发酵即指此种发酵方式。静态密闭式固态发酵反应器，主要有托盘式或填充床式反应器，这些系统均不包含搅拌设备。2024/11/543801、托盘式发酵特点：①相对比较薄的发酵基质铺在一个面积相对比较大的托盘上；②没有强制的通风，但在托盘上可以有孔，空气可以缓慢地在托盘的周围循环；③发酵基质的温度随着反应器周围环境的温度而变化，因此可以通过控制反应器所在的空间温度来控制反应器的内部温度。问题：

①操作难以实现机械化，属“劳动密集型”生产方式；②由于发酵基质是静态的，因此传质、传热困难，这就使托盘上所添加的基质的厚度往往只有几厘米到十几厘米。2024/11/54480托盘式发酵设备2024/11/545802、填充床式发酵2024/11/54680静态密闭式固态发酵工艺控制1、温度控制2、水分控制2024/11/54780三、动态密闭式固态发酵技术1、转鼓式发酵2024/11/548801、转鼓式发酵转鼓式反应器的主要特色是空气不是从基质的底部吹人而是从基质的顶部吹过，空气和基质的热量和物质交换是通过反应器的转动来促进。转鼓式固态反应器热量的传递主要有两种途径：一是直接通过对流和蒸发将热量传递到反应器的顶部空气；二是由反应器的壁通过传导传递。这种反应器可以用干空气增加基质的水分蒸发来降温，因为这样的反应器可以从顶部通过喷水来调节基质的水分含量。转鼓式反应器的装料系数一般是0.3。2024/11/549802、搅拌式发酵2024/11/550802、搅拌式发酵搅拌式固态发酵两种主要类型：水平搅拌式的和转鼓式。在水平搅拌式中，发酵基质的运动是由搅拌轴的运动来提供动力的；而在转鼓式中是由罐体的运动来提供的。除此以外，二者其他方面都很类似。垂直式的反应器一般都要强制通风。2024/11/551803、气固流化床发酵2024/11/55280流化床发酵的特色和优点①由于通气良好，因此有助于好氧微生物的生长，在流化床上生长的微生物呼吸率可以达到静态培养的10倍；②代谢热的去除十分完全，不会发生培养基温度过高的问题；③气体和挥发性的代谢产物可以很快消失，减小抑制；④混合效果很好，消除了发酵基质中的温度和湿度梯度，有利于过程中的工艺参数的控制；⑤某些产物（如单细胞蛋白）可以直接在反应器中进行干燥；⑥相对于传统的固态培养，生产效率大大提高，因此可以减少生产所占用的空间和生产操作费用。2024/11/553804、立式多层固态发酵罐2024/11/55480立式多层固态发酵罐特点立式多层固态发酵采用的发酵罐具有占地面积小、自动化程度高、生产能力大、易于监测和控制等优点。发酵物料可以在发酵罐内进行蒸煮、灭菌、降温等操作，更重要的是实现了发酵罐内接种、发酵罐内喷淋加湿、自动翻料、温湿度自动检测显示、自动进出料等自动控制操作过程。可以在常温、常压下工作，利用夹套、内蛇管和无菌空气进行加热和冷却。由于发酵物料是在密闭条件下进行发酵，而且进入发酵罐内的空气和水都经过灭菌处理，完全消除了杂菌污染的可能性，最终产品的质量有了确切的保证。2024/11/55580操作及应用范围立式多层固态发酵罐在投料前先进行空罐灭菌，发酵物料从发酵罐顶部人料孔加人，进入发酵罐底下第一层，然后翻起第二层堆料板，加第二层料，依次按此步骤进行加料。然后进行蒸煮、灭菌。发酵物料的控温是依靠发酵罐的内蛇管、外夹套冷却水以及罐底压人的无菌空气，然后从罐顶排出。目前，国内已有0.5—10m3规格的立式多层圆桶形固态发酵罐出售，可以用于菌体蛋白、纤维素酶、淀粉酶、四环素、赤霉酸、红曲、醋曲、酱曲的生产，生物制药（包括生物农药），饲料和菜籽饼固态发酵产酶等许多领域。2024/11/55680在固体发酵过程中进行搅拌具有以下一些特点和要求：①设计上必须符合清洁无菌的卫生要求；②要求对固体基质施加的剪切力较小；③固体基质经预处理（浸泡、灭菌）后，可通过固体搅拌器内部接种，以避免染菌；④可通过搅拌保证添加水分分布均匀，以便于控制水分含量；⑤通过外部冷却夹套和搅拌提高温控效果。2024/11/55780四、气相双动态固态纯种发酵技术气相双动态固态纯种发酵新技术的研制成功，标志着现代固态发酵技术的成熟。大致可归纳为以下三个方面：（1）打破现代发酵工业中液体深层发酵技术的垄断局面（2）开辟新的生物技术产业（3）对传统固态发酵生产技术的改进2024/11/558801、打破现代发酵工业中液体深层发酵技术的垄断局面有许多现行的液体发酵法生产过程，都可以用此现代固态发酵技术代替。典型的有Bt发酵、纤维素酶发酵、果胶酶发酵、固氮菌发酵、赤霉素发酵、核黄素发酵等。以此类推，整个酶制剂工业都有可能转成以固态发酵法为主体。其他还有农用抗生素、有机酸等，也有部分代替的可能。2024/11/559802、开辟新的生物技术产业典型事例是如白僵菌、绿僵菌等在液体中不产生分生孢子，必须采用现代固态发酵技术。更重要的是，木质纤维素的生物转化与生物量全利用是人类可持续发展战略中的重大课题，现代固态发酵技术将是该课题最终克服技术经济关的突破口。可开创众多的新产业：①以酒精为代表的清洁液体燃料工业；②高效有机生物肥工业；③菌体饲料蛋白工业；④饲料添加剂工业等。2024/11/560803、对传统固态发酵生产技术的改进压力脉动操作往往可使发酵时间缩短1／3，变温操作往往可提高菌体活性。在复合菌群组合优化方面也可发挥作用。因此对传统制酒，及风味食品制造方面提供技术改进的新途径，甚至创制新的风味发酵食品、保健食品等，例如用红曲霉固态发酵制红曲霉素及保健食品等。2024/11/56180（一）气相双动态固态纯种发酵的工艺过程图4－11双筒式双动态固态发酵罐示意图2024/11/56280图4－12单筒式双动态固态发酵罐示意图2024/11/56380图4－13小推车盘架系统2024/11/56480图4－14小推车盘架机械输送系统2024/11/56580气相双动态固态纯种发酵工艺特点①无固体层机械翻动装置，由薄层、气相双动态及循环风机达到传质与传热要求；②由于无固体翻动机械传动，反应器结构简单容易密封，便于工业放大；③反应器为受压容器，可用压力蒸汽进行严格的空罐或实罐灭菌，无死角，便于清扫；④采用无菌压缩空气供氧，发酵过程中反应器为正压状态，故能严格达到纯种固态培养的要求；2024/11/56680⑤气相双动态有促进微生物代谢、强化细胞内外的传质，减少代谢产物的反馈抑制，从而有缩短发酵周期、提高转化率的功能；⑥反应器的环形结构与循环鼓风机，使反应器内的温度、湿度均匀一致；⑦反应器内设置冷却排管，加之循环风机配合后，强制罐内气相空气顺次通过物料和冷却排管，降低发酵物料的温度，并便于反应器内温度与湿度的调控；⑧气相双动态的周期、振幅与波形由进出气阀的适时自动控制系统完成，可以随发酵过程对供氧与发热要求进行计算机在线优化控制。2024/11/56780（二）气相双动态固态发酵的机制气相双动态固态发酵中气体内循环的目的是使气相始终处在对流扩散状态。内循环速率变化也应与微生物的代谢状况相对应，随着微生物代谢活动的加剧，气体内循环速率也应增加。但风速太大，填料层表面基质将被吹起。风速可以通过马达转速及风扇功率估计。在气相双动态固态发酵中，培养基料层的厚度、气体脉冲压力变化范围、气体内循环速率等都会影响发酵。由于是密闭系统，气相双动态固态发酵中能很好保持水分。2024/11/56880五、吸附载体固态发酵技术传统的固态发酵不足之处：①固体培养基既是碳源，又是它们的结构组成部分，在微生物发酵生长过程中，培养基被分解了，底物容易结块，孔隙率也降低。由于底物的外形和物理特性都发生了变化，结果降低了发酵过程中的传质和传热。②固体物中的杂质容易带入发酵提取液中，难以应用于纯度要求高的发酵产品。③由于底物的不均匀性，难以维持发酵反应的稳定性和一致性，生物量和代谢产物的成分不易分析，不利于发酵过程的控制以及动力学研究与模型建立等。2024/11/56980（一）吸附载体固态发酵的特点吸附载体固态发酵的特点特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质作为微生物的载体，营养成分可以严格控制，发酵结束，只需将菌体和培养液挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。吸附载体固态发酵可以克服传统固态发酵存在的许多问题2024/11/570801、选用适宜的惰性吸附载体充当固态发酵的固相，可以克服底物结块、传质和传热差的难题，避免固体物中的杂质带人发酵提取液中；2、由于多孔吸附载体在无游离水状态下固态发酵，利于气—液—固传递，发酵水平比液体发酵提高3～5倍，设备投资比液体深层发酵低得多；3、能够维持固态发酵过程中环境的均匀性与一致性；4、容易分析生物量和代谢产物，利于发酵过程的控制以及动力学研究与模型建立；5、采用培养基实消、液体种子在位无菌接种和在位超声控湿等配套的无菌操作方法，解决大规模固体培养基难以灭菌和大规模无菌接种的问题；6、该技术拓宽了固体发酵应用范围，具有广泛的适用性与推广意义。2024/11/57180

吸附载体固态发酵与深层液态发酵相比的优点由于吸附载体固态发酵过程中，固态载体提供了微生物生长的巨大表面，单位体积的比表面积可以始终维持在很高的水平，微生物可以在通人少量或不需要通入空气或氧气的条件下，从外界中获得自身生长所需的氧气，因此，不需要通人大量无菌氧气或空气，也不需要强力搅拌，节省能源。2024/11/57280（二）吸附载体固态发酵的载体选择惰性吸附载体是吸附载体固态发酵中一个关键因素。为了确定微生物适合的载体，应了解微生物发酵周期、载体材料的吸附等温线、载体发酵过程物理化学变化以及水活度对微生物生长的影响。另外，对于载体的选择还要依赖于所选用的生物反应器。如在非搅拌发酵反应器中，如果载体使用不当就会造成反应湿度低，结果会抑制微生物的生长。而在搅拌发酵反应器中，载体应能够承受搅拌所造成的剪切力，并且能够保护菌丝体不受搅拌的影响。载体还必须耐蒸汽加热或药物灭菌，多孔结构既有足够的表面积，又能允许空气流通。2024/11/57380对于吸附载体需考察以下几个物理性质（1）表观密度：在23℃环境下，用游标卡尺测定载体试片的规格尺寸为5.0cm×5.0cm×2.5cm，并称取它的质量，然后计算出表观密度。（2）测定气泡平均孔径：用一只小型放大镜，数出位于2.0cm长度直线上的气泡数，并计算出气泡平均孔径。（3）最大吸水率：把规格尺寸为5.0cm×5.0cm×2.5cm的试片浸入23℃的水中，用戴聚乙烯手套的手在水中挤压试片，直至没有气泡出来时再放松，使其充分地吸水。最大吸水量最大吸水率＝×100％吸水前载体试片的质量（4）开孔率最大吸水率×表观密度开孔率＝

0.9975式中：0.9975表示水在23℃时的密度。（5）载体吸水性在固态发酵时，为了能够减小发酵过程中因水分挥发而引起水活度的降低，惰性载体应能够在发酵过程中缓释出部分水，以维持发酵过程水活度的稳定。2024/11/57480（三）吸附载体固态发酵过程分析惰性载体吸附固态发酵技术既不同于利用农作物产品为底物的传统固态发酵，也不同于液态搅拌通气发酵。其不同点主要有以下几个方面：惰性载体吸附固态发酵提高了固态发酵过程中环境的均匀性与一致性；为微生物生长提供了一个巨大的界面环境，强化了发酵过程中的氧、热等的传递过程；提供了一个不存在很强的剪切力作用的发酵环境。2024/11/575801、吸附载体固态发酵提高了固态发酵环境的均匀性传统固态发酵过程