02-紫外可见分光光度法

紫外可见分光光度法分光光度法基本原理：测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内对光的吸收度，对物质进行定性、定量分析。分类：吸收光波长范围200～400nm，可用于物质的定性和定量分析吸收光波长范围400～780nm，用于有色物质的定性和定量分析吸收光波长范围2.5—1000m，用于已知结构的有机化合物鉴别紫外分光光度法可见分光光度法红外分光光度法

紫外和可见分光光度法合称为紫外—可见分光光度法。1定性鉴定各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线2纯度检验用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。如果一化合物在紫外区没有吸收峰，而其杂质有较强吸收，就可方便的检出该化合物中的痕量杂质。3结构分析紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。应用P43第一节紫外-可见分光光度计的使用P14分光光度计工作原理：采用一个可以产生多个波长的装置，通过系列分光装置，得到一束平行的波长范围很窄的单色光，透过一定厚度的试样溶液后，部分光被吸收，剩余的光照射到光电元件上，产生光电流，在仪器上可读取相应的吸光度或透光率，完成测定。0.575光源单色器吸收池检测器显示1.单波长单光束分光光度计简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性，且操作麻烦，任一波长的光均要用参比调T=100﹪后，再测样品一、紫外可见分光光度计类型2.双光束分光光度计比值光源单色器试样池检测器显示光束分器自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。是目前用的最多的分光光度计。裂参比池3.双波长分光光度计光源单色器单色器切光器检测器吸收池两种不同波长的单色光，经切光源后，分时交替照射于同一吸收池，再由检测器测量和记录样品溶液对两束波长的吸收差。不需要参比溶液；可以消除背景吸收干扰；适合多组分混合物、浑浊试样的定量分析，可以测定较高浓度的样品溶液。可进行导数光谱分析。价格昂贵。二．紫外可见分光光度计的组成部分光源单色器吸收池检测器显示系统1．光源

在所需光谱区域内发射连续的、足够强度、稳定的辐射光。可见区：钨灯、碘钨灯；

通常用6～12V钨丝灯作可见光区的光源，最适宜的使用范围在360—800nm。氙灯氢灯钨灯紫外区：氢灯、氘灯、氚灯光源应该稳定，即要求电源电压保持稳定。为此，通常在仪器内同时配有电源稳压器。色散原理：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同分光入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ2800600500400单色器是将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。单色器由棱镜或光栅等色散元件及狭缝和透镜等组成。其中色散元件是关键部件。2．单色器

（1）棱镜：根据光的折射原理而将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过一个很窄的狭缝照射到吸收池上。玻璃棱镜用于可见光范围，石英棱镜则在紫外和可见光范围均可使用。（2）光栅：在镀铝的玻璃表面刻有多条等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。

光栅可根据光的衍射和干涉原理将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过狭缝照射到吸收池上。其分辨率比棱镜大，可用的波长范围也较宽。3．吸收池吸收池也称比色皿，用于盛放参比溶液或待测溶液。它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃制成的，按其厚度分为0.5cm，1cm，2cm，3cm和5cm。在可见光区测量吸光度时使用玻璃吸收池，紫外区则使用石英吸收池。使用比色皿时应注意保持清洁、透明，避免磨损透光面。经常使用的吸收池应于清洗后浸泡在蒸馏水中保存。

使用前需配对检验，成套吸收池其透光率之差应<0.5%

。

4．检测器

检测器的作用是接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行测量。分为光电管和光电倍增管。光电管：光电管依其对光敏感的波长范围不同分为红敏和紫敏两种。红敏光电管是在阴极表面涂银和氧化铯，适用波长范围为625—1000nm；紫敏光电管是阴极表面涂锑和铯，适用波长范围为200—625nm。光电倍增管：灵敏度最高，比光电管高200多倍。光电管改进而成，管中有若干称为倍增极的附加电极。适用波长范围为160～700nm。光电倍增管在现代的分光光度计中被广泛采用。显示装置的作用是把放大的信号以吸光度A或透光率T的方式显示或记录下来。分光光度计常用的显示装置是检流计、微安表、数字显示记录仪。

很多型号的分光光度计装配有微处理机，一方面可对分光光度计进行操作控制，另一方面可进行数据处理。5．显示系统三、紫外可见分光光度计的使用方法定性分析基础定量分析基础物质对光的选择性吸收在一定实验条件下,A∝cA

c增大AB

A

第二节紫外-可见分光光度法的定性分析P81、分子吸收光谱的产生在分子中，除了电子相对于原子核的运动外，还有核间相对位移引起的振动和转动。这三种运动能量都是量子化的，并对应有一定能级。电子能级振动能级转动能级BA若用△E电子、△E振动、△E转动分别表示电子能级差、振动能级差、转动能级差则△E电子

△

E振动

△

E转动分子的总能量可以认为是这三种能量的总和：

E分子=E电子+E振动+E转动当一束光照射到某物质或某溶液时，组成该物质的分子、原子或离子等粒子与吸光子作用，光子的能量发生转移，使原子核外层电子由低能量轨道跃迁到高能量轨道，即由基态转变为激发态。M(基态)+h

M*(激发态)这个过程即是物质对光的吸收。当用频率为

的电磁波照射分子，由于分子、原子或离子的能级是量子化的，不连续的，只有光子的能量(h

)与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差(

E)相等时，才能被吸收。△E=h（h为普朗克常数）不同物质的基态和激发态的能量差不同，选择吸收光子的能量也不同，即吸收的波长不同。

具有单一波长的光叫单色光，比如红，蓝光等。

由不同波长的光组成的光叫复色光。比如日光等

如两种适当颜色的单色光按适当的强度比例混合能得到白光，则这两种颜色的光叫做互补色光。

2、光的种类P7溶液的颜色

⑴溶液为什么会有颜色？

由于溶液中的质点选择性地吸收某种颜色的光所引起的。

⑵吸收光与溶液颜色的关系：

当白光通过某一均匀溶液时：CuSO4溶液：之所以呈蓝色，是因为吸收了白光中的黄光，透过其黄光的互补光蓝光。①如溶液对其全不吸收，光全透过，溶液为无色；②如溶液对其全部吸收，无光透过，溶液呈黑色；③如溶液对其部分吸收，其余光透过，溶液呈透过光的颜色。2、物质吸收光谱曲线P8

某一溶液对何种波长的光吸收？吸收的程度如何？

这可通过使不同波长的光通过某一固定浓度的有色溶液，分别测量每一波长下对应的光的吸收程度[吸光度

A]，作A-λ曲线，即吸收光谱曲线。KMnO4溶液的max=525nm

max/nm吸收强度绿光被吸收特点:①为带状光谱，具有最大吸收波长。②不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似，

max不变。但是不同物质，其吸收曲线形状和

max不一样，所以可作为定性分析的依据。③不同浓度的同一种物质，在

max处吸光度随浓度变化的幅度最大，测定的灵敏度最高，所以通常选取在

max处测量。1）生色团：含有π键的不饱和基团，简单的生色团由双键或三键组成（如乙烯基、乙炔基等）2）助色团：本身没有生色功能（不能吸收波长大于200nm的光），但当与生色团连接时，有增强生色团生色能力的基团吸电子：极性基团，如—OH，—NH2，—NHR，-OR,-SH，-SR给电子基团：带有n电子（未成键的孤对电子）的杂原子基团，如-Cl，-Br等3、紫外吸收图谱的常用术语P39

（3）蓝移、红移蓝移（或紫移）：指吸收峰向短波长方向移动，红移：指吸收峰向长波长方向移动（共轭效应、引入助色团或改变溶剂的极性）。吸收波长:-CH3I>-CH3Br>-CH3OH>

-CH3Cl>CH3F

习题P46第20题（4）增色效应和减色效应前者指吸收强度增加，后者指吸收强度减小。（1）270-750nm无吸收峰。饱和化合物，单烯。（2）

270-350nm有吸收峰（ε=10-100L/（mol*cm）），含有一个简单的非共轭且含有n电子的生色团（3）

250-300nm有中等强度的吸收峰,（ε=200-2000L/（mol*cm

），如苯环。（4）

210-250nm有强吸收峰，表明可能含有2个共轭双键；在260nm,300nm,330nm有强吸收峰，说明是3个或3个以上双键的共轭体系。

（5)若吸收峰延伸至可见光区，则可能是长链共轭或稠环化合物

习题P46第21,22题4、常见有机化合物的紫外可见吸收光谱一、朗伯-比尔定律

朗伯-比尔定律是说明物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度和液层厚度间关系的定律。第三节紫外可见分光光度法的定量分析P91、透光率和吸光度入射光强度I0，吸收光强度Ia，透过光强度It，反射光强度为IrI0

＝Ia+It+Ir被测溶液和参比溶液的吸收池同样材料和厚度，反射光强度影响相互抵消，上式简化为I0＝

Ia+It

透射光的强度It与入射光的强度I0的比值称为透光率(T)透光率愈大，溶液对光的吸收愈少。透光率的负对数称为吸光度(A)当A为0时，T（%）为100吸光度愈大，溶液对光的吸收愈多。

1760年，Lambert指出：一束平行单色光通过有色溶液后，光的吸收程度与溶液液层的厚度成正比。A=k1·b

1852年，Beer指出：一束平行单色光通过有色溶液后，光的吸收程度与溶液的浓度成正比。A=k2·c将Lambert定律和Beer定律合并起来，就得到Lambert-Beer定律。A=K·b·c2、光的吸收定律(Lambert-Beer定律)c：物质的量浓度(mol·L-1)b：为液层厚度(cm)K:吸光系数。应用的条件：入射光必须是单色光；吸收发生在稀的均匀的介质中；吸收过程中，吸收物质互相不发生作用。其数值的大小，与物质的性质、入射光波长、溶剂种类及溶液温度等因素有关。当波长等其他因素一定时，只与物质的性质有关。两种表示方法：

a：质量吸光系数(L·g-1·cm-1)；

：摩尔吸光系数(L·mol-1·cm-1)。特点：不随浓度和液层厚度的改变而改变，作为定性鉴别的参数；在

max处的摩尔吸光系数，常用

max表示，。不同物质的λmax有时可能相同，但

max不一定相同，作为定性的依据；

max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高3、吸光系数（K）例：Cd2+浓度为140umol·L-1

，双硫腙法显色测定波长为520nm，液层厚度2cm，吸光度为0.22，求

和透光率T。解：(1)

A=

bc

0.22=

214010-6

=785.7L·mol-1·cm-1(2)A=－lgT

=0.22

lgT=－0.22

T=10－0.22

=0.60=60%标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。引起这种偏离的因素（两大类）：（1）光的因素，即仪器的非理想引起的；（2）化学因素。正偏离负偏离Ac标准曲线4、影响朗伯—比耳定律的因素（1）光的因素

单色光不纯，导致负偏差。

散射光的影响，胶体、乳浊液或悬浊液由于散射的作用使吸光度增大，或入射光不是垂直通过比色皿（非平行入射光）产生正偏差为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器。此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。(2)化学因素吸光质点的相互作用，浓度较大时，产生负偏差，朗伯-比尔定律只适合于稀溶液（C<10-2mol/L)。

平衡效应：溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。

例：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：

CrO42-＋2H＋

=Cr2O72-＋H2O

溶液中CrO42-、Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液pH对测定有重要影响。

根据Lambert-Beer定律，以该物质吸收光谱图中的λmax为入射光，首先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液cs，测其As，再将样品溶液推入光路，测其Ax

，则试样溶液的浓度cx为：此法适于非经常性的分析工作，准确度不如标准曲线法。二、紫外可见分光光度法的定量方法P24目视比色法——标准系列法原理：将标准溶液与被测溶液在同样的条件下进行比较，当溶液液层厚度相同,颜色深度一样时,两者的浓度相等。1.单一组分的测定例：维生素B12的含量测定精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀释至10.00mL；另配制对照液，精密称定对照品25.00mg，加水稀释至1000mL。在361nm处，用1cm吸收池，分别测定吸光度为0.508和0.518，求B12注射液注射液的浓度（单位ug/mL)⑴测定步骤

①首先配制一系列被测物的标准溶液，测其吸光度，绘出A-c工作曲线；②在相同条件下，测出被测物的吸光度Ax;③根据Ax的值在工作曲线上查处cx的大小。⑵适用范围大批重复试样的分析。(2)标准曲线法(工作曲线法)P292、多组分的定量方法P32三种情况：（1）两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）

两组分在各自λmax下不重叠→分别按单组分定量令E=εbλ1→测A1→b组分不干扰→可按单组分定量测Caλ2→测A2→a组分干扰→不能按单组分定量测Ca（2）两组分吸收光谱部分重叠原则：比尔定律、加和性原理步骤：（3）两组分吸收光谱完全重叠——混合样品测定3、差示分光光度法P33当在吸光度很高或很低的范围内进行定量分析时，相对误差比较大。本法是用比试样浓度稍低（高吸光度差示分光光度法）或稍大（低吸光度差示分光光度法）的溶液做参比溶液进行测定。高吸收法在测定高浓度溶液时使用。选用比待测溶液浓度稍低的已知浓度溶液作标准溶液，调节透光率为100%。低吸收法在测定低浓度溶液时使用。选用比待测液浓度稍高的已知浓度溶液作标准溶液，调节透光率为0。最精密法是同时用浓度比待测液浓度稍高或稍低的两份已知溶液作标准溶液，分别调节透光率为0或100%。

物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性、pH等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。第四节紫外可见分光光度法的条件选择P28(一）测定波长的选择“吸收最大

max

，干扰最小”A

X

maxY

（二）参比溶液(空白溶液)在测定时用空白溶液调节仪器A=0(T=100%),以消除溶液中其它物质的干扰,抵消比色皿对光反射、吸收.1)溶剂参比：只有被测组分有色，试液、试剂、显色剂均无色(无吸收)，则可用溶剂如纯水作参比溶液.2)试剂参比：试液无色,显色剂或其它试剂有色(有吸收),则应选试剂空白.3)试样参比：试剂、显色剂均无色(无吸收),试液中其它组分有色,则应采用不加显色剂的试液作参比溶液.选择参比溶液的总原则是:使试液的吸光度能真正反映待测组分的浓度.4)退色参比：指在吸光试样溶液（或显色溶液）中加入适当试剂，将吸光物质或显色化合物破坏（或颜色退去）后的溶液.1086420204060800.70.40.20.1AT%Er(36.8)0.434浓度测量的相对误差与T(或A)的关系实际工作中，应控制T在15～65％,

A在0.2～0.8之间(调溶液浓度，吸收池厚度)（三）、吸光度的测量范围

最佳值最佳读数范围（四）、显色反应条件的选择P271.显色剂的选择

灵敏度高，选择性好。（一对一）

Cu~NH3（绿蓝色）

e620=1.2×102

Cu~双硫腙（紫红色）

e533=5.0×104显色产物组成恒定,性质稳定。显色产物与显色剂色差大,显色时颜色变化明显，试剂空白值小。