第10章紫外-可见分光光度法2012

第十章紫外—可见分光光度法1主要学习1.紫外-可见分光光度法用于测定什么样的物质？2.该方法的吸光质点是什么？3.什么类型的物质能够产生紫外-可见吸收？4.定性、定量的依据是什么？5.紫外-可见分光光度计的主要结构如何？2前言定义：光谱区：200~800nm。对象：广泛用于无机和有机物质的定性和定量测定。3特点分子光谱灵敏度较高（一般10－4～10－6g/ml）准确度好（一般0.5％）操作简便、快速应用广泛4(一)分子吸收光谱的形成1.过程：分子的价层电子--------吸收外来辐射------产生电子能级跃迁-----分子吸收谱。第一节紫外—可见光谱法的原理和概念

一、电子跃迁类型5分子的总能量可以认为是这三种能量的总和：

其中

Ee最大：1-20eV;

Ev次之：0.05-1eV;

Er最小：

0.05eV2、能级组成6有机分子能级跃迁可能的跃迁类型有机分子包括:成键轨道、；反键轨道

*、*非键轨道n

C

H

H

Ooooo

=

=

o=n(二)电子跃迁类型7各轨道能级高低顺序：

n

*

*；可能的跃迁类型：

-

*；

-

*；n-*；n-*81.

-

*：C-H共价键，如CH4（125nm）；C-C键，如C2H6(135nm)，处于真空紫外区；

2.

n-*：含有孤对电子的分子，如H2O(167nm)；CH3OH(184nm)；CH3Cl(173nm);(CH3)2S(229nm)；CH3NH2(215nm)；可见，大多数波长仍小于200nm，处于近紫外区。以上跃迁都与成键和反键轨道有关，跃迁能量较高，这些跃迁所产生的吸收谱多位于真空紫外区，因而在此不加讨论。而

-

*和n-*两种跃迁的能量小，相应波长出现在近紫外区甚至可见光区，且对光的吸收强烈，是我们研究的重点。9

-

*和n-*两种跃迁3.

*跃迁吸收峰一般处于近紫外光区，在200nm左右。其特征是摩尔吸光系数大，一般

max

104，为强吸收带。

如：乙烯（蒸气）的

max为165nm。丁二烯的

max为217nm。1011

-

*和n-*两种跃迁n

*跃迁

这类跃迁发生在近紫外光区。它是简单的生色团如羰基、硝基等中的孤对电子向反键轨道跃迁。其特点是谱带强度弱，摩尔吸光系数小，通常小于100。125.电荷迁移跃迁当电磁辐射照射化合物时，电子从给予体向与接受体相联系的轨道上跃迁。电荷迁移跃迁实质是一个内氧化—还原的过程。电荷迁移吸收带的谱带较宽，吸收强度较大，摩尔吸光系数

max可大于104。无机化合物的跃迁类型136.配位场跃迁（即d-d跃迁和f-f跃迁）在配体存在下，过渡元素的d或f轨道发生能级分裂，电子在能级分裂的轨道上跃迁。特点：摩尔吸光系数较小，一般εmax<102，位于可见光区。14二、紫外可见吸收光谱的常用概念1.吸收光谱*(absorptionspectrum)又称吸收曲线：

A-λ曲线，如图10-3所示：2.吸收峰*：(λmax)

曲线上吸光度最大的地方。对应的波长称最大吸收波长。15163.谷*：(λmin)

峰与峰之间吸光度最小的地方。对应的波长称最小吸收波长。4.肩峰*(shoulderpeak)：

在一个吸收峰旁边产生的一个曲折。5.末端吸收*(endabsorption)：

只在图谱短波端呈现强吸收而不成峰形的部分。300400500600350525545Cr2O72-MnO4-1.00.80.60.40.2AbsorbanceCr2O72-、MnO4-的吸收光谱35017

6.生色团*

从广义来说，所谓生色团，是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。但是，人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团。

187.助色团*

助色团是指带有非键电子对的基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于200nm的光，当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸光度。198.红移*

(redshift)：亦称长移，是由于化合物的结构改变使吸收峰向长波方向移动的现象。如发生共轭作用、引入助色团，以及溶剂改变等。209.蓝移*（紫移）(blueshift)：亦称短移，是化合物的结构改变时或受溶剂影响使吸收峰向短波方向移动的现象。2110.增色效应和减色效应*：

由于化合物结构改变或其他原因，使吸收强度增加称增色效应或浓色效应；使吸收强度减弱称减色效应或淡色效应。

2211.强带和弱带(strongbandandweakband)：

强带：εmax值大于104的吸收峰，弱带：εmax值小于102的吸收峰。

23三、吸收带及其分子结构的关系

跃迁类型相同的吸收峰称为吸收带(absorptionband)。

吸收带是说明吸收峰在紫外-可见光谱中的位置。根据电子和轨道种类，可把吸收带分为六种类型。241.R带从德文radikal(基团)得名。n→π*跃迁2.K带从德文konjugation(共轭作用)得名。共轭双键中π→π*跃迁3.B带从benzenoid(苯的)得名，256nm4.E吸收带，苯环中三个共轭烯π→π*跃迁，180nm和200nm左右5.电荷转移吸收带6.配位体场吸收带25四、影响吸收带的因素

主要是分子中结构因素和测定条件等多种因素的影响，它的核心是影响分子中电子共轭结构。261.

位阻影响能共轭，吸收带长移2.

跨环效应形成类似共轭的作用，吸收带长移3.溶剂效应极性溶剂使π→π*跃迁吸收峰长移；而使n→π*跃迁吸收峰短移4.体系的pH的影响27下表为溶剂对亚异丙酮紫外吸收光谱的影响。

正己烷CHCl3CH3OHH2O

*

max230238237243n

*

max329315309305因此，在实际工作中，你的测定结果和文献不完全一致，也是有可能的。28五、朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律Lambert-Beer定律的数学表达式：A=-lgT

=ECl

或T=10-A=10-ECl

其中E是吸光系数(absorptivity)，与单色光、溶剂和温度等条件有关。

吸光系数是定性和定量的依据。29吸光系数有两种表示方式：1.摩尔吸光系数*（ε或E）

指在一定波长时：A=ε•

1(mol/L)•1cm2.比吸光系数或称百分吸光系数指在一定波长时：A=E1cm1%

•

1％(W／V)•1cm两者之间的关系？30两种吸光系数之间的关系：

ε=E1cm1%•M/10（M为摩尔质量）通常ε在104～105之间为强吸收，ε＜102为弱吸收，102＜ε＜104中强吸收。吸光系数ε或E用已知准确浓度的稀溶液测得。31例如：氯霉素(M为323.15)的水溶液在278nm处有吸收峰。设用纯品配制100ml含有2.00mg的溶液，以1.00cm厚的吸收池在278nm处测得透光率为24.3%。则：E=-lgT/(C•l

)=307ε=E•M/10=992032

吸光度的加合性：A总＝Aa

+Ab

+Ac+••••••

因为电磁波照射分子时，所有要吸收相同辐射的跃迁，都要引起吸光度。这是直接测定混合组分的依据。33六、偏离比尔定律的因素

（一）化学因素由于溶液浓度改变而产生的离解、缔合、与溶剂间的作用等原因而发生偏离Beer定律的现象。

01234mg/mLA。。。。*0.80.60.40.20工作曲线34例如，重铬酸钾的水溶液有以下平衡：

Cr2O2-7+H2O2H++2CrO2-4

若溶液稀释2倍，Cr2O2-7离子浓度不是减少2倍，而是减少明显地多于2倍，结果偏离Beer定律，而产生误差。35（二）光学因素1.非单色光（一定波长范围的光）2.杂散光(straylight)

不在谱带宽度范围内的与所需波长相隔较远的光。3.散射光和反射光（透射光强度减弱）4.非平行光（光程差）36(三)透光率测量误差（T）

浓度相对误差取决于透光率和透光率测量误差ΔT的大小。以吸光度A和浓度相对误差作图，当A值在0.2～0.7，是测量最适宜范围。曲线最低点时：T=0.368A=0.4343

透光率测量误差最小。37第二节紫外-可见分光光度计一、组成部件

紫外-可见分光光度计的基本结构是由五个部分组成：光源、单色器、吸收池、检测器和信号指示系统。383940414243仪器基本结构光源单色器吸收池检测器和信号显示系统44作用：提供能量，激发被测物质分子，使之产生电子谱带要求：发射足够强的连续光谱，有良好的稳定性及足够的使用寿命类型：可见与近红外区：钨灯400~1100nm

紫外区：氢灯或氘灯180~400nm一、光源45作用：从连续光源中分离出所需要的足够窄波段的光束常用的元件：棱镜、光栅二、单色器46功能：用于盛放试样，完成样品中待测试样对光的吸收常用的吸收池：石英（紫外区）玻璃（可见区）吸收池光程：1cm、2cm、3cm等注意：为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。吸收池要挑选配对，因为吸收池材料的本身吸光特征以及吸收池的光程长度的精度等对分析结果都有影响。三、吸收池47作用：接受光信号，并把光信号转化为电信号组成：检测器、放大器常用检测器：光电管和光电倍增管蓝敏（锑铯）光电管210~625nm

红敏（氧化铯）光电管625~1000nm

四、检测系统48五、信号指示系统

作用：放大信号并以适当方式指示或记录下来。

常用装置：有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。

49二、紫外-可见分光光度计的类型（一）几种光路类型主要有：单光束分光光度计双光束分光光度计双波长分光光度计5051

对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。52（二）光学性能分光光度计光学性能的说明：1.波长范围：195～820nm2.波长准确度：误差≤±0.5nm3.波长重现（复）性：变动值≤0.5nm4.透光率（T）测量范围：0～150%5.吸光度（A）测量范围：-0.1730～+2.00之间。536.光度准确：

透光率满程误差为≤±0.5%7.光度重复性：变动性≤±0.5%8.分辨率：260nm处为∆λ=0.03nm9.杂散光：通常以测光讯号较弱的波长处(如200或220nm，310或340nm处)所含杂散光的强度百分比为指标。220nm处NaI(1%g/ml)≤0.5％。54（三）分光光度计的校正

通常在实验室工作中，验收新仪器或实验室使用过一段时间后都要进行波长校正和吸光度校正。

1.波长的校正镨铷玻璃或钬玻璃都有若干特征的吸收峰，可用来校正分光光度计的波长标尺，前者用于可见光区，后者则对紫外和可见光区都适用。552.吸光度的校正(即标准溶液校正)

其中以铬酸钾溶液应用最普遍，《中华人民共和国药典》(2000版)附录采用重铬酸钾的硫酸溶液(0.005mol／L)。3.吸收池的校正(A、B配对互换)

A→试样溶液，B→参比溶液；A→参比溶液，B→试样榕液，测量吸光度。要求前后两次测得的吸光度差值应小于1%。其校正值可供以后实验中使用。56第三节紫外-可见分光光度分析方法一、定性分析主要依据是有机化合物的吸收光谱特征（形状、数目、位置、强度和ε等）。采用对比法（试样光谱与标准图谱进行对照比较）：相同，则可能是同一化合物；有明显差别，则肯定不是同一化合物。571.对比吸收光谱特征数据（λmax、ε或E）2.对比不同波长处的吸光度（或吸光系数）的比值不只一个吸收峰的化合物，可用不同吸收峰处（或峰与谷）测得吸光度的比值作为鉴别的依据。

58例如：维生素B12的鉴别，中国药典规定在361nm与278nm吸光度的比值应为1.70～1.88；361nm与550nm吸光度的比值应为3.15～3.45。593.对比吸收光谱的一致性在相同条件下（且浓度相同），比较样品与标准品的吸收光谱图是否一致。60二、纯度检查杂质检查（定性）①待测化合物无吸收，杂质有强吸收；②若化合物有强吸收，而杂质无吸收或很弱，则ε降低；③若杂质更强的吸收，ε增大。2.杂质的限量检测（控制杂质的限量）①控制杂质在特定λ处的吸光度A值；②用峰谷吸收度的比值控制杂质的限量。61三、单组分的定量方法（一）吸光系数法：即C=A/εl

通常ε和Ｅ可从手册或文献中查到。例：维生素B12的水溶液在361nm处的Ｅ值是207，盛于1cm吸收池中，测得溶液的吸光度为0.414，则溶液的浓度为：C=0.414/（207×1）=0.0200（g/100ml）

若用ε计算，则是每升含mol数。62（二）校正曲线法（标准曲线法）即：A＝KC(10.9)（三）对照法：即：CX=AX/

AS•

CS63校准曲线法参比标准样品待测样品64四、同时测定多组分的定量方法——计算分光光度法（一）根据吸光度的加合性（两组分）1.两组分的吸收峰不重叠，无干扰；a不重叠652.相互重叠，利用各组分的吸收光谱不同，测定的A联立求解，即A1a+b=A1a+A1b=E1a

Ca+E1bCbA2a+b=A2a+A2b=E2a

Ca+E2bCbb重叠66五、结构分析（一）有机化合物的紫外吸收光谱根据特征光谱，可以推定分子的骨架、判断发色团之间的共轭关系和估计共轭体系中取代基的种类、位置和数目。要确定物质的分子结构，必须与红外、质谱和核磁共振等配合。67

紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。因此681.饱和烃的价值

饱和烃类分子中只含有键，只能产生*跃迁。饱和烃的最大吸收峰一般小于150nm，已超出紫外、可见分光光度计的测量范围。

常选用作溶剂。

692.含孤立助色团和生色团的饱和有机化合物①H被O、N、S、X等取代，n

*跃迁，能量小，长移。（见表10-5）70

饱和卤代烃，卤素原子上存在n电子，可产生n

*的跃迁。例如，CH3Cl、CH3Br和CH3I的n

*跃迁分别出现在173、204和258nm处。这些数据不仅说明氯、溴和碘原子引入甲烷后，其相应的吸收波长发生了红移，也显示了助色团的助色作用。71②含孤立生色团：n

*

和n

*跃迁（表10-6），因含杂原子双键，故还会产生

*跃迁，150～180nm。例：酮和醛有三个吸收峰：n

*跃迁吸收峰在190nm左右；

*吸收峰在150～180nm之间；n

*

吸收峰在275～295nm之间。723.共轭烯烃①两个双键中间若有2个以上-CH2-，其吸收峰的位置与一个双键相同，强度约增加一倍。②若是共轭系统，π→π*跃迁将长移，化合物可由无色→有色。734.α、β不饱和酮、醛、酸和酯①若C=C和C=O双键未形成共轭化合物，

*跃迁，约在200nm附近有两个强吸收峰，约在280nm处有羰基的n

*

吸收峰。②在α、β不饱和醛、酮中，由于C=O和C=C共轭，使

*长移至200～260nm，而n

*跃迁长移到310～350nm，ε<100。

74③溶剂对不饱和酮、醛的影响，溶剂极性增加使

*带红移，而使n

*

带蓝移。④羧酸和酯的

*跃迁吸收峰比相应的酮、醛的吸收峰长移，而n

*跃迁相对短移。755.芳香族化合物(1)苯和取代苯：在紫外光区苯有三个吸收带El、E2和B带，均由π→π*跃迁产生的，B带的精细结构是芳香化合物特征，在极性溶剂中消失。当苯环上有取代基时，苯的三个带都长移，B带简单化。76

取代基的性质不同红移效应不同，其红移的强弱次序大致如下：供电子取代基(electrondonatinggroup)：-CH3＜

-Cl

＜-Br＜-OH＜-OCH3＜

-NH2＜

-O＜-NHCOCH3＜

-NCH3

吸电子取代基（electronwithdrawinggroup）：-NH3+＜-SO2NH2＜-COO-≤-CN-＜

-COOH＜-CHO＜-NO2

77助色团取代：孤对电子杂原子取代，产生n

*

共轭，E2