分子生物学实验方法与步骤

分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37OC溶解,定容至100ml,棕色瓶存于室温。2、1.5MTris-HCl(pH8.0：Tris18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。3、1MTris-HCl(pH6.8：Tris12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。4、10%SDS：电泳级SDS10.0g加ddH2O68℃助溶,浓盐酸调至pH7.2,定容至100ml。5、10电泳缓冲液(pH8.3：Tris3.02g，甘氨酸18.8g，10%SDS10ml加ddH2O溶解,定容至100ml。6、10%过硫酸铵（AP）：1gAP加ddH2O至10ml。7、2SDS电泳上样缓冲液：1MTris-HCl(pH6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS0.6g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O3.5ml。8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25g，甲醇225ml，冰醋酸46ml，ddH2O225ml。9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O4.0ml30%储备胶3.3ml1.5MTris-HCl2.5ml10%SDS0.1ml10%AP0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl封底,余加TEMED4μl,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。（凝胶完全聚合需30-60min）2、积层胶（4%）的配制：ddH2O1.4ml30%储备胶0.33ml1MTris-HCl0.25ml10%SDS0.02ml10%AP0.02mlTEMED2μl将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。（二）样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000g×1min，取上清作SDS分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。（三）上样:取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中,并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。（三）电泳:在电泳槽中加入1电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压60V,分离胶电压100V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需3hr）。（四）染色:将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，室温4-6hr。（五）脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,多次脱色至蛋白带清晰。（六）凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。三、注意事项1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。室温较低时，TEMED的量可加倍。3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。表达蛋白的分离与纯化大肠杆菌表达蛋白以可溶和不溶两种形式存在，需要不同的纯化策略。现在，许多蛋白质正在被发现而事先并不知道它们的功能，这些自然需要将蛋白质分离出来后，进行进一步的研究来获得。分析蛋白质的方法学现已极大的简化和改进。必须承认，蛋白质纯化比起DNA克隆和操作来是更具有艺术性的，尽管DNA序列具有异乎寻常的多样性（因而它是唯一适合遗传物质的），但它却有标准的物理化学性质，而每一种蛋白质则有它自己的由氨基酸序列决定的物理化学性质（因而它具有执行众多生物学功能的用途）。正是蛋白质间的这些物理性质上的差异使它们得以能进行纯化但这也意味着需要对每一种待纯化的蛋白质研发一套新的方法。所幸的是，尽管存在这种固有的困难，但现已有多种方法可以利用，蛋白质纯化策略也已实际可行。目前，待研究蛋白或酶的基因的获得已是相当普遍的事。可诱导表达系统特别是Studier等发展的以噬菌体T7RNA聚合酶为基础的表达系统的出现使人们能近乎常规地获得过表达（overexpression），表达水平可达细胞蛋白的2%以上，有些甚至高达50%。一、可溶性产物的纯化（融合T7·Tag的表达蛋白）（一）试剂准备采用T7·TagAffinityPurificationKit1．T7·Tag抗体琼脂。2．B/W缓冲液：4.29mMNa2HPO4，1.47mMKH2PO4，2.7mMKCl，3.0.137mMNaCl，1%吐温-20，pH7.3。4.洗脱缓冲液:0.1M柠檬酸，pH2.2。5.中和缓冲液：2MTris，pH10.4。1.PEG20000。（二）操作步骤1.100ml含重组表达质粒的菌体诱导后，离心5000g×5min，弃上清，收获菌体，用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。2.重悬液于冰上超声处理，直至样品不再粘稠，4℃离心14000g×30min，取上清液，0.45μm膜抽滤后作为样品液。3.将结合T7·Tag抗体的琼脂充分悬起，平衡至室温，装入层析柱中。4.B/W缓冲液平衡后样品液过柱。5.10mlB/W缓冲液过柱，洗去未结合蛋白。6.用5ml洗脱缓冲液过柱，每次1ml，洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集，混匀后置于冰上，直接SDS分析。7.将洗脱下来的蛋白放入透析袋中，双蒸水透析24hr，中间换液数次。8.用PEG20000浓缩蛋白。（三）注意事项蛋白在过层析柱前，要0.45μm膜抽滤，否则几次纯化后，柱子中会有不溶物。二、包涵体的纯化包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。包涵体的主要成分就是表达产物，其可占据集体蛋白的40%～95%，此外，还含有宿主菌的外膜蛋白、RNA聚合酶、RNA、DNA、脂类及糖类物质，所以分离包涵体后，还要采用适当的方法（如色谱法）进行重组蛋白质的纯化。（一）试剂配制1．缓冲液A：50mMTris-HCl（pH8.0）,2mMEDTA,100mMNaCl。2．缓冲液B：50mMTris-HCl（pH8.0）,1mMEDTA,100mMNaCl,1%NP-40。3．缓冲液Ⅰ：50mMTris-HCl（pH8.0）,2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100(V/V,4M脲素。4．缓冲液Ⅱ：50MTris-HCl（pH8.0）,2mMEDTA,100mMNaCl,3%TritonX-100。1．缓冲液Ⅲ：50mMTris-HCl（pH8.0）,2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,2M盐酸胍。5．缓冲液C：8M脲素，10mMβ-巯基乙醇，100mMTris-HCl（pH8.0），2mMEDTA及脱氧胆酸钠。（二）操作步骤1．用缓冲液A漂洗菌体细胞（10ml/g）,离心6000g×15min，收集菌体细胞，重复此步骤，将菌体细胞再在缓冲液A中洗涤一次。2．将漂洗过的菌体细胞悬浮于缓冲液B中，超声破碎，镜检，破碎率高于95%，离心1500g×30min，收集包涵体沉淀。3．将包涵体沉淀用缓冲液Ⅰ、缓冲液Ⅱ、缓冲液Ⅲ分别超声洗涤一次，1500g离心收集包涵体沉淀。4．包涵体的溶解：用含高浓度脲素的缓冲液室温放置30min，然后离心1500g×30min，留上清。将溶解后的蛋白质适当稀释，磁力搅拌，透析过夜。5．溶解后的包涵体蛋白可通过亲和层析进一步纯化。表达蛋白的生物学活性的检测一、MTT比色法检测细胞活性（一）原理活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能催化无色的MTT形成蓝色的甲肷，其形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。对细胞活力有影响的表达蛋白活性检测可以通过MTT比色法进行。（二）试剂准备1、青链霉素溶液（100X）：青霉素100万U，链霉素100万U，溶于100mlddH2O中,抽滤除菌。2、L15基础培养基：1000mlL15培养基，加2g碳酸氢钠，10ml100X青链霉素，5mlHEPES。3、MTT液：5mg/ml溶于L15基础培养基。4、SDS处理液：20gSDS，50μl二甲基甲酰胺，加双蒸水50ml溶解。5、L-多聚赖氨酸：50μg溶于1ml双蒸水中。6、L15基础培养基溶解的不同浓度的蛋白液。（三）操作步骤（以背根神经节细胞培养为例）1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠背根神经节（DRG）。2、镜下去除神经根和外膜，放入1ml0.1%胶原酶中37℃消化30min，每5min摇匀一次。3、洗去胶原酶，吹打分散后，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔含100μl无血清L15培养基，细胞约800个。4、实验组分别加入纯化的表达蛋白（分别以不同的蛋白浓度），阴性对照加入等体积表达蛋白的溶剂。5、37℃5%CO2培养48hr后，每孔加入10μlMTT，37℃5%CO2孵育4hr。6、加入100μl20%的SDS处理液，37℃孵育20hr。7、用EL×800微孔酶标仪测定OD570值，数据分析。二、DRG无血清培养检测促神经生长作用（一）操作步骤：1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠DRG。2、镜下去除神经根和外膜，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔1个DRG。3、待DRG贴壁后加入100μl无血清L15基础培养基，实验组加入纯化的表达蛋白（分别以不同的蛋白浓度），阴性对照加入等体积的溶解表达蛋白的溶剂。4、37℃5%CO2培养，每天在Olympus倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并进行测量，其数据作统计分析。二、注意事项1、MTT有毒，注意防护。2、单个DRG贴壁实验操作难度较大，需仔细耐心。放射性同位素标记的DNA序列测定分析测定DNA的核苷酸序列是分析基因结构与功能关系的前提。从小片段重叠法到加减法、双脱氧链终止法、化学降解法、自动测序，DNA测序技术发展很快。目前在实验室手工测序常用Sanger双脱氧链终止法。Sanger法就是使用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸序列的方法。它要求使用一种单链的DNA模板或经变性的双链DNA模板和一种恰当的DNA合成引物。其基本原理是DNA聚合酶利用单链的DNA模板，合成出准确互补链，在合成时，某种dNTP换成了ddNTP，这时，DNA聚合酶利用2’,3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，使之掺入到寡核苷酸链的3’末端，导致3’末端无3＇-OH，从而终止DNA链的生长，双脱氧核苷酸的种类不同，掺入的位置不同就造成了在不同的专一位置终止的长度不同的互补链。通过掺入放射性核苷酸和聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可读出模板DNA的互补链序列。一、试剂准备１．硅化液：四氯化碳250ml，二氯二甲基硅烷25ml。２．6%变性PAGE胶的配制：丙烯酰胺28.5g，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺1.5g，10×TBE50ml，尿素210g，加ddH2O至500ml搅拌溶解，0.22μm滤膜过滤，4℃贮存于棕色瓶中。使用时取50ml加入催化剂过硫酸铵（25%）50μl，TEMED50μl，轻摇混匀，立即灌胶。3.质粒DNA碱变性液：NaOH2M，NaAc3M（pH4.8），无水乙醇，70%乙醇。4.T7测序试剂盒。二、操作步骤1.测序板硅化，流水、ddH2O洗，无水乙醇洗，晾干。2.灌胶：装好测序板，玻璃板以15-30°角度倾斜放置，用50ml注射器将凝胶灌到两块玻璃之间，将鲨鱼齿梳子的平端插入胶的上缘，深约0.5-1cm。夹好，将测序板放水平。聚合约3hr后预电泳。3.预电泳：按照说明要求安装好电泳装置，在上槽和下槽注入1×TBE。设置温度50℃，功率100W，时间约30min。（同时准备测序反应）4.质粒DNA双链碱变性：DNA3-5μg溶于32μlddH2O中，加2NNaOH8μl，混匀，室温静置15min。加3MNaAc7μl，无水乙醇120μl，混匀，-20℃放置30min。离心12000g×15min，弃上清，70%乙醇500μl洗一次，离心12000g×7min。弃上清，晾干沉淀，10μl灭菌ddH2O溶解。5.模板与引物复性：加2μl测序引物、2μlAnnealingbuffer，混匀，稍稍离心，65℃温育5min，立即放置于37℃10min，室温5min以上。6.标记反应：加3μllabelingmixture、1μl相应放射性同位素（10μCi）、2μlT7测序酶（使用前以稀释液1∶5稀释），混匀，离心，置37℃5min。7.预先准备四个0.5ml微量离心管，标上A、C、G、T，分别在其中加入2.5μl的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。8.链终止反应：在A、C、G、T四个微量离心管中分别加入反应液4.5μl，37℃5min。加入stopsolution5μl，短暂离心。9.上样：关上预电泳电源，冲洗胶平面，将鲨鱼齿插入胶平面中约1-2mm形成加样孔。将四个反应管置80℃2min。立即取1.5-2μl加到加样孔上。10．电泳:50℃，100W，电泳2.5hr后，暂停电泳，在预留孔二次上样后，继续电泳2.5hr。11．下胶：停止电泳，取下测序板，倒掉电泳缓冲液。拆开测序板，凝胶应粘在未硅化的的玻璃板上。裁一张比胶稍大一些的滤纸，平铺在胶上，掀起滤纸，凝胶就被一起掀起。12．压片：将凝胶盖上保鲜膜，用monitor测读放射强度，以估计曝光时间。在暗室中覆上X光片，置暗夹中，-70℃放射自显影。13．洗片、读片：取出暗夹，回到室温。经D72显影、酸性定影液定影，水洗,晾干。在X光片灯上读出序列。三、注意事项1.测序板清洗、硅化的好坏直接影响灌胶及下胶。处理不好时容易导致灌胶时气泡的产生，下胶时则易使电泳胶损坏。2.灌胶时要避免胶的渗漏；注射器将凝胶灌到两块玻璃之间时，注意速度的控制，防止气泡的产生。3.测序反应及电泳上样时要注意小心操作，防止放射性同位素污染，同时要加强整个后续实验过程中自身的防护。4.规范、妥善处理放射性同位素接触物品及废弃物。手工测序需要使用同位素，这给操作带来许多不便，对操作者也有一定的损害。DNA测序仪的出现解决了这一问题，它不使用同位素标记，自动化程度高，测序效果好。虽然DNA测序仪的价格目前仍比较高，但每次测序的花费并不算高，而且商品化服务也令人满意。聚合酶链反应一单链构象多态性分析(PCR-SSCP聚合酶链反应-单链构象多态性分析（SingleStrandConformationPolymorphismAnalysisofPolymeraseChainReactionProducts,PCR-SSCP）是近年来发展起来的一种基因分析方法。PCR-SSCP分析的基本程序为：首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果，现已发展多种PCR-SSCP技术，各有其优势及适用领域。例如，可以在PCR扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷，也可以在电泳后用银染或溴化乙锭染色以显示结果。这里将重点介绍最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在进行PCR扩增特定靶基因序列时，利用γ-32P-ATP标记引物或直接在PCR反应体系中加入α-32P-dCTP进行PCR扩增，使扩增产物带有同位素标记物，然后将扩增产物变性为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射自显影显示结果。利用引物标记或碱基掺入法使PCR扩增产物带有同位素标记物，均可使产物信号增强几个数量级。二者相比较，前者经济、扩增特异性强，多用于大样本的检测和筛选；后者操作简便，适于一般实验室开展，可用于小样本或大样本的检测和筛查。本节仅介绍同位素标记碱基掺入法。一、试剂准备⒈PCR相关试剂⒉α-32P-dCTP⒊30％聚丙烯酰胺（29：1）：丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺1g，溶于100mlddH2O中，4OC保存。⒋10％过硫酸胺配制方法：1g过硫酸胺，溶于10mlddH2O中，4OC保存（可用数周）。⒌TEMED（N，N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）⒍5×TBE缓冲液：Tris碱54g、硼酸27.5g、0.5MEDTA(pH8.020ml，加ddH2O至1000ml。7．变性上样液：95%甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚蓝、20mMEDTA(pH8.0二、操作步骤⒈PCR扩增反应总体积为10μl，在0.5ml微量离心管中加入下列反应成分：10×buffer1μldNTPmix70μMDNA模板100ng引物及TaqDNA酶依实验设计要求按比例加入α-32P-dCTP0.1μl加ddH2O至10μl按实验设计循环参数进行扩增，获取扩增产物。⒉聚丙烯酰胺凝胶电泳⑴电泳槽玻璃板的处理：用洗涤剂清洗玻璃板，自来水反复冲净洗涤剂，双蒸水冲洗3次，晾干，95％乙醇擦拭，自然干燥。用棉签沾取SigmaCote涂于玻璃的贴胶面上，5～10min后再用软纸擦拭除去多余的SigmaCote溶液。在两块玻璃内的两侧放好衬条对齐，用固定夹夹紧两块玻璃，并用玻璃胶带封边。⑵制胶：按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积，一般来讲使用5％～8％的凝胶较为合适。轻轻摇匀配制的胶液于真空抽气（开始时要缓慢）除气泡，加35μlTEMED至聚丙烯酰胺混合液中，混匀。用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取胶液，将玻璃模具倾斜成60O角，缓慢注入两玻璃板间的空隙中，直至灌满模具顶部。立即插入相应的点样梳，（小心勿使梳齿下带进气泡，并且不要将梳齿全部插入胶内，留约2mm梳齿于玻璃板上端，以免拔梳时把胶孔拔断）。由于凝胶在聚合过程中有回缩，所以应小心添加些胶液于梳子处，水平放置，室温聚合1hr。将封口玻璃胶带掀去，放入电泳槽，凹型玻璃贴紧电泳缓冲液槽，用大号固定夹固定住两侧。在上下电泳槽内灌入1×TBE电泳缓冲液。小心取出点样梳，用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。⑶扩增产物的处理：将PCR扩增产物与变性上样液按1：5的比例加入0.5ml微量离心管中，混匀。样品上胶前应98oC变性10min，立即冰浴骤冷。取约3～5μl变性样品（根据点样孔的大小决定上样量），以微量加样器上样，（上样时要注意不要有气泡冲散样品，而且速度要快，时间长了样品易于扩散）。⑷电泳：电泳槽接上电极（上槽接负极，下槽接正极）开启电源，根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小，决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l～5V／cm电泳。⑸剥胶：电泳结束后，倒弃电泳缓冲液，取下电泳胶玻璃，用塑料楔子从玻璃板底部一角小心分开玻璃，凝胶应附着在一块玻璃上，切去凝胶左上角，作为点样顺序标记。剪一张与玻璃同样大小的滤纸，严密覆盖于凝胶上，顺一个方向将凝胶缓慢取下，用保鲜膜盖于胶面并包好，避免膜和胶之间产生气泡或皱折，将凝胶固定在X线片夹中。⑹放射自显影：在暗室中将X线片贴于胶面，盖严片夹，用黑布将X线片夹包裹，置-70OC放射自显影。曝光时间根据同位素的强度而定，约24h～10d。⑺冲洗胶片从-70oC取出X线片夹，在暗室内迅速取出X线片，立即显影，以免使X线片上出现过多的冷凝水。（如果想再得到一张放射自显影影像，可立即在片夹中装一张新X线片并尽快放回到一70oC继续显影。如果来不及再加入新片即已出现冷凝水则应使样品凝胶和X线片夹都恢复到室温，并擦去冷凝水后再装入新的X线片）。依次按以下程序操作进行显影：X线片显影液显影1-5min水洗lmin定影液定影5min流动水冲洗15min所有使用液的温度应为18～20OC为宜。三、注意事项⒈核酸片段的大小:用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于<200bp的片段，SSCP可发现其中70％的变异；对于300bP左右的片段则只能发现其中50％的变异；而＞500bp的片段，则仅能检出10％～3O％的变异，因此，<300bP，尤其是150bP左右的核酸片段更适于SSCP分析。对于大于400bp的PCR产物就需要设法进一步处理，可以用限制性酶消化PCR产物，产生小于400bP的DNA片段，再进行SSCP分析。⒉游离引物:游离引物可能同PCR产物结合而改变其泳动率，即使游离引物量为6nM都有明显影响。因此，应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引物扩增方法，尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。或者是稀释PCR产物，减少游离引物的干扰。⒊低浓度变性剂:凝胶中加入低浓度的变性剂，如5％-10％甘油、5％尿素或甲酸胺、10％二甲亚砜（DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因为轻微改变单链DNA的构象，增加分子的表面积，降低单链DNA的泳动率。但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。因此，对同一序列使用2～3种条件做SSCP，可能提高敏感性。⒋电泳温度:一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素，温度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象，从而影响突变的检出。室温下电泳适于大多数情况，但由于在电泳时温度会升高，为确保电泳温度相对恒定，应采取以下措施：减少凝胶厚度，降低电压，有效的空气冷却或循环水冷却等。⒌凝胶的长度:可用测序板进行SSCP分析，凝胶板长度在40cm以上。⒍凝胶浓度及厚度:凝胶浓度很重要，一般使用5％～8％的凝胶，凝胶浓度不同，突变带的相对位置也不相同，如果在进行未知突变种类的SSCP分析时，最好采用两种以上凝胶浓度，这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对SSCP分析也很重要，凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量使凝胶越薄越好。⒎假阴性:一般认为，如没有污染，PCR－SSCP分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照，结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是否为突变带。由于PCR－SSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未知基因变异的检测，假阴性结果就难以百分之百地消除。8.结果分析:单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，一般形成两条单链带。PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底，残留双链亦可形成一条带．因此，PCR－SSCP分析结果至少显示三条带。但是，由于一种DNA单链有时可形成两种或多种构象，检出三条或四条单链带就不足为奇。聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2由少量mRNA生成cDNA文库；(3从cDNA中克隆某些基因；(4生成大量DNA以进行序列测定；(5突变的分析；(6染色体步移；(7RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。一、试剂准备1.DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCRBuffer4．2mMdNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5．Taq酶二、操作步骤1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。10×PCRbuffer5μldNTPmix（2mM）4μl引物1（10pM）2μl引物2（10pM）2μlTaq酶（2U/μl）1μlDNA模板（50ng-1μg/μl）1μl加ddH2O至50μl视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2．调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃40s→58℃30s→72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。三、PCR反应体系的组成与反应条件的优化PCR反应体系由反应缓冲液（10×PCRBuffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。各个组份都能影响PCR结果的好坏。1．反应缓冲液：一般随TaqDNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mMKCl，10mMTris-HCl（pH8.3室温），1.5mMMgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg2+为1.5mM较合适。若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。2．dNTP：高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。3．TaqDNA聚合酶酶：在100μl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如20μl或50μl），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。4．引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：⑴引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4(G+C+2(A+T］。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。⑵引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。⑶人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。⑷引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pM/μl较好。⑸引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100μM），保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。5．模板：PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。6．PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。四、注意事项１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。最好设立一个专用的PCR实验室。２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。４．PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。带有相同末端(平端或粘端的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。（二）T4DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O至8μl。3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。4．加入含ATP的10×Buffer1μl，T4DNA连接酶合适单位，用ddH2O补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃水浴）连接8-14hr。四、连接产物的转化1.感受态细胞的制备⑴保存于-70℃的DH5α（或其他菌种）用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现（约14-16hr）。⑵挑取单菌落，接种于2.0mlLB液体培养基中，37℃恒温，250g振荡培养过夜（约12hr）。⑶取0.5ml过夜培养液，接种于100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2hr。（注：以下操作均应在冰浴中进行。）⑷将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10min，弃去上清，用冰浴的0.1MMgCl225ml悬浮30min。⑸4℃离心,4000g×10min，弃去上清，加入冰浴的0.1M