F02蛋白质化学二：蛋白质三维结构与功能s

蛋白质三维结构与功能-蛋白质3D结构取决于其氨基酸序列-蛋白质功能由其结构所决定-天然蛋白具有惟一或近乎惟一的结构-蛋白质结构的稳定主要依赖非共价性弱相互作用-不同的蛋白质具有某些基本结构模式

1VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGGDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASEDLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRHPGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYGG1°AAsequenceSpace-fillingmodel3Dstructureshowingatoms

一级氨基酸序列决定3D结构(以肌红蛋白为例)-为何有利?-如何形成?P7-1Myoglobin

-153AA

-Singlepeptidechain+hemeheme疏水残基N-terminusC-terminus2Glychymotrypsin

纤维蛋白和球蛋白的一般结构胰凝乳蛋白酶胶原蛋白collagen相对稳定一般不溶于水单一、重复的二级结构常为结构组分动态大多为水溶性由多种二级结构组建一般为活性蛋白outer:hydrophilicinner:hydrophobic36-2b肽键具有部分双键性而不能自由旋转C

–N旋转角

C

–C旋转角

肽链处于充分伸展构象时

和

均规定为180º其取值都将受到肽平面的限制§1.

肽单位是一个具有极性的平面单位肽键连接的重复单位(–C

–C–N–C

–)4

肽键以共振杂化形式存在单键式双键式共振杂化式(反式)肽的C-N键略短：(resonancehybrid)羰基O具有部分负电荷而酰胺N具有部分正电荷，结果形成一个小电偶极，可同时用作H键供/受体几乎所有的肽键均以反式构型存在共振杂化作用

-限制绕肽键自由旋转

-肽键具有~40%双键性

-形成肽平面

-肽键存在永久偶极6-2a5W2.4N-endC-endtrans相邻残基的C

分别处于肽键两侧cis相邻残基的C

处于肽键同侧Pro肽键的顺/反构型对邻近C

上侧链基团的影响差别不大

肽单位构型顺式中相邻C

的侧链基团干扰大6W2.5(a)(b)

多肽主链在构象上受到很大限制

(不能自由旋转的肽键占1/3主链)肽平面处于稳定的伸展构象肽平面处于一种不稳定的构象(相邻肽单位羰基O的vanderWaals半径重叠)7

并非所有的

和

角都允许

P8-4要想使

和

均为0º将导致与同一个C

连接的两个肽单位处于同一平面上，这实际上是不可能的：羰基O和酰胺H将发生空间重叠8TabW2.1只有当大量的连续残基都具有类似的φ和ψ值时才会形成相应的二级结构3.613-螺旋(C

–N旋转)(C

–C旋转)94-4(2nd)N-C

(f)C

-C(y)a-helix3.613-螺旋：

氢键封闭的13元环螺距5.4Å(1.5Å/AA)H-bond几乎平行于长轴除了末端残基外，

-螺旋中各个肽键的–NH和–CO都可参与形成两个H键

(n±4)§2.

-螺旋是一种常见的二级结构10R-侧链指向

-螺旋外侧有利于减少立体障碍去稳定性因素…

-相邻带同种电荷侧链之间的互作

-相距太近时，Asn,Ser,Thr,Leu等残基的侧链大小和形态可影响稳定(Hy)Pro…-不可能绕N-C

旋转而引入结节-酰胺N上也没有H可供形成H键Gly…

-侧链仅为H，太容易绕C

旋转稳定性因素…

-每隔~3个残基的正、负电荷侧链离子对

-每隔~3个残基的芳香族侧链的疏水互作

Influenceofsidechainsona-helixstabilityP8-11116-11×2×4×8×32初原/中纤维之间的二硫键交联(未显示)可进一步增加毛发、皮肤和指甲等整体结构的稳定性，而且二硫键愈多质地也愈坚硬双股左手螺旋链右手螺旋原细丝初原纤维中纤维

毛发结构(角蛋白构建)12b6-2

烫发的生化反应13

Parallelb-strandH-bonds6.5ÅREPEATC

NP8-13R-groupsprotrudeinoppositedirections同向远比

-螺旋更为伸展§3.

-折叠由伸展的多肽链组成14polypeptidechainalmostfullystretchedout

Antiparallel

b-strandH-bonds7ÅREPEATCaCaCaC

NC

NN

CP8-14反向morevertical与

-螺旋的链内氢键不同，-折叠主要依赖链间氢键维系其稳定15

Protein3-Dstructure:silkfibroin,afibrousproteinLayersofantiparallel

b-sheets,richinAlaandGly,

permittingclosepackingofb-sheetswithan

interlockingarrangementofR-groups:StabilizedbyH-bondingbetweenallpeptidelinkagesineachb-strandandbyoptimizationofvanderWaalsinteractionsbetweenb-sheetsP9-5大多数丝心蛋白的一级结构中都含有长重复序列片段-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala-丝心蛋白spinnerets16AA3=GlyinTypeIIb-turnsoftenfoundnearsurfaceofaprotein:peptidegroupsinAA2and3arefreetoformH-bondswithwaterb-turns:180°,by4AAP8-16§4.

-转角在蛋白质中也很普遍

176-13相邻的各股胶原螺旋均错位排列，每5行重复一次结缔组织的增龄性僵直和脆化主要与某些特殊的分子内/间共价交联衍生物的增多有关去氢羟赖氨酰正亮氨酸

(withoutCys)§5.胶原蛋白中存在有不同的螺旋结构18

Collagen:atriplehelixwithaunique2°structureRepeatingtripeptideofGly-Pro-HyPro

adoptsleft-handedhelixwith~3AA/turn3heliceswrappedroundoneanotherwithright-handedtwist=1collagenmoleculeGlycinesfoundatthetightjunctionwherethe3chainsareincontact(-N-Hdonor)P9-319于1959年以X-射线法测定出Mb的晶体结构：153个AA残基大多处于8个

-螺旋中(A→H)，大小约为~44×44×25ÅV7-1血红素

hemeMyoglobin(Mb)球蛋白三级结构特点-常由不同的二级结构元件组成-疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链多暴露在表面-多肽链折叠盘绕呈球状-表面有裂隙，常为活性部位

eg.enzymesand

regulatoryproteinsJohnC.Kendrew1917-1997

(NPinChemistry,1962)§6.肌红蛋白是首个被确定具有三级结构的蛋白质20HisF814656-17

血红素

Hemegroup-主体为原卟啉Ⅸ的四吡咯环系统-呈不饱和且高度共轭的平面结构-羧乙基取代基可与临近的碱性残基以盐桥/离子键连接-还原态Fe2+取代原卟啉Ⅸ中的2个H+

而形成共振杂化体亚甲基桥连接吡咯环Fe2+配位键21P9-6-肌红蛋白三级结构(whale’smyoglobin)Space-fillingmodelwith

allAAsidechainsHeme－His

F8疏水氨基酸侧链(Leu,Ile,Val,Phe,Met)大多位于分子内部而形成致密的疏水核心，H2O基本上均被排出(仅剩能容纳4H2O的空间)8

-helicalsegments(~80%ofMb’s153AA)除去heme以外的多肽链成分为珠蛋白(脱辅蛋白)疏水裂隙22

一些小分子蛋白质的3D结构6-18核糖核酸酶细胞色素c溶菌酶functiongroups(usu.incleft)23t6-2羧肽酶常见单肽链蛋白质的基本二级结构组成24一级结构上相距甚远的残基可能在三级结构中靠得很近而导致其侧链基团相应互作-非极性残基间的疏水互作(3)是多肽链折叠的主要驱动力(熵效应)-vanderWaals力(4)和氢键(2)有助于稳定球蛋白的高级结构

(foldstrategy)-共价交联(5)和离子互作

(1)亦可协助维持天然构象的稳定§7.

球蛋白的折叠依赖于各种弱互作25水分子围绕疏水溶质形成的笼形结构将导致其有序度增加而熵值相应减小，结果将迫使疏水溶质之间形成净吸引(=疏水互作)G2-5

疏水互作(~entropyeffect)2627

-起始结构单元的形成有助于后续结构单元的正确排列

-酶催化的异构反应可以协助多肽链折叠

蛋白质二硫键异构酶(PDI)催化二硫键交换或改组以确定天然配对方式

肽酰脯氨酰顺反异构酶加速脯氨酰肽键的异构化

-分子伴侣能提高多肽链的正确折叠率§8.

蛋白质折叠是协同、有序进行的28

蛋白质二硫键异构酶作用机制(proteindisulfideisomerase)还原态PDI通过二硫键交换反应催化非天然态二硫键重排以产生其天然态连接非天然态二硫键(热力学不稳定)天然态二硫键(热力学稳定)296-30①DnaJ和DnaK依次与松散/部分折叠的肽链相互作用②DnaJ激活DnaK水解

ATP，DnaK-ADP与松散的肽链紧密结合③GrpE(ingerm)

激活ADP的释放，

使DnaJ与DnaK脱离④ATP与DnaK结合、进入下一轮循环或释出已形成天然构象的蛋白质非结合区段形成(部分)正确折叠

分子伴侣作用机制结合松散/部分折叠的肽链，避免裸露的疏水片段不恰当地结合Chaperonin在真核类尚未确定其存在相当于真核类的Hsp40和Hsp70(cf.p81&633)30常见变性因素

-pH

影响AA残基侧链解离状态断裂氢键/破坏离子对/形成电荷排斥区

-加热引起振动/增加旋转能量

-化学试剂破坏疏水互作断裂二硫键等共价连接Denaturation-变性某些环境因素或化学剂可能导致蛋白质天然构象被破坏并伴随其生物活性的丧失相当于某些弱互作解体而使多肽链呈随机卷曲构象吴宪(1893-1959)

§9.

变性因素可引起蛋白质去折叠

3126-8440-9558-11065-72ChristianAnfinsen1916-1995

牛胰RNaseA变-复性实验(1957)naturalRNaseA

-124AA

-4pairs-S-S-99%配对不正确酶活性仅有1%2-巯基乙醇intheair1972NPinChemistry32-蛋白质的天然构象通常处于某种边缘性稳定

(变性所需能量通常仅相当于3~4个氢键被破坏)-某些蛋白质在形成随机卷曲构象时就已经是完全去折叠了，但有些在变性时却仍能保留相当多的内部结构，因而在一定的条件下可以复性或重新折叠(eg.消除变性因素)renaturation-变-复性研究的理论意义：直接证实蛋白质的天然构象是由其一级结构所确定的变-复性实验推论…-二硫键是在多肽链依据其一级结构提供的信息自发折叠成其天然构象之后才形成的，以维系/锁定蛋白质构象的相对稳定33helix-loop-helix(

)

hairpinGreekkeyW2.14

超二级结构是基本二级结构元件的组合motif-通常由一级结构的相邻片段所组成§10.

球蛋白还具有超二级结构和结构域

34

结构域是三级结构内的球状分立单位

迂回

/

折叠桶W2.15domain-通常涉及到一级结构中相距较远的片段-一般都具有特殊功能，eg.

结合小分子配体356-21

由若干个类似的

基元构建而成的

/

折叠桶兔丙酮酸激酶的一个结构域疏水结合或反应区36甘油醛-3-磷酸脱氢酶的双结构域亚基(x4)V6-30底物结合结构域肌钙蛋白CCa-结合结构域结构域的形成：

-动力学上更为合理-功能上便于结合底物辅基结合结构域

大蛋白一般含有多个结构域37-血红蛋白是四聚体-血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线不同-血红蛋白是别构蛋白-镰形细胞贫血病是一种分子病MaxPerutz&JohnKendrewspentnearly20yearsforsolvingthestructuresofmyoglobinandhemoglobin.NPinChemistry1962

"fortheirstudiesofthestruc-turesofglobularproteins"§11.

具有四级结构的蛋白质是球状亚基的组装体

38

subunits(141AA)

subunits(146AA)6-23Hb实际上是

二聚体(

互作要比/

的强得多)Hemoglobin(2

2

)⑴血红蛋白是四聚体四级缔合具有结构与功能优越性3*108

Hb/RBC(~4.5mmol/L)39

脱氧Hb各亚基间有八对盐键-

链内两对-

链间四对-

-链间两对7-9Alloftheselinksareabolishedinthedeoxytooxytransition.氧合时均断开40MbMbP50=2.8HbP50=26-高p(O2)时，Mb/Hb对O2的亲和性都很高，几乎均被饱和-低p(O2)时，Mb对O2的亲和性则明显高于Hb的，使O2

被转移到Mb上Zh2-22两者的生理作用与其在低氧分压下对O2的相对亲和性直接相关

⑵Mb和Hb的氧解离曲线不同工作肌肉中毛细血管p(O2)∆y<10%∆y>70%肺泡p(O2)41Zh2-23/24协同效应(cooperation)一个亚基与配体的结合会影响到另一个亚基结合其配体的能力

Hb与O2的结合表现为正协同效应(Perutz

mechanism)T态

未结合O2时

和

呈对角排列，结构较紧密R态

结合O2后

和

的长轴呈现15º夹角，结构相对松弛Hb的T-R态互变+O2–O2tensestaterelaxedstate427-10-T→R态转换使各亚基均发生相对位移，进而影响到某些离子对之间的相互作用两对盐桥因HisHC3旋转移位进入亚基间的空穴而不复存在T→R态转换导致亚基间空穴缩小437-11-F螺旋肽段在Hb结合O2时发生的相对位移被认为是触发T→R态转变之关键结合O2后Fe2+因自旋态变化而半径变小，进入卟啉环0.6Å，通过拖动HisF8而影响附近的肽段构象

亚基之间的盐键断裂

使亚基之间的结合松弛而转变为R态44-BPG在正常生理条件下带的电荷为–5-正常红细胞约含4.5mmol/LBPG，几乎与Hb等摩尔G15.36⑶Hb是别构蛋白(allostericprotein)2,3-Bisphosphoglycerate

2,3-二磷酸甘油酸(BPG)是Hb的重要别构效应物别构效应结合于蛋白质分子特定部位的配体对该蛋白其他部位产生的影响(eg.改变亲和力/催化能力)45BPG能结合在T态Hb的中央空穴中而使之稳定，但R态中该空穴因两条链C-末端残基的移入而不足以容纳BPGG15.37BPG的5个负电荷被两条

链伸出的8个阳离子基团所包围Val

1(NA1)His

2(NA2)Lys

82(EF6)His

143(H21)[Ser143?for

HbF(

2

2)]Glu→Val导致HbS46BPG和CO2对Hb的O2解离曲线的影响G15.35ChristianBohr1855-1911Bohr

effectCO2使Hb对O2的亲和性下降CO2+H2O

H++HCO3–

pH

质子化

形成有助于T态稳定的离子对~10%O2morereleasedwhenpH7.4→7.247

BPG与高原适应~3,000m高度上的氧分压仅为海平面的70%(~110mmHg)

动脉血氧分压

(<85mmHg有害)生理性适应-红细胞大量合成BPG4.57.5mmol/L仅需1~2天-增加红细胞数量一般需要数周时间/血液粘滞度

-加大红细胞的[Hb]正常值(~4.5mmol/L)已近结晶态[BPG]

Hb与O2亲和力

Hb释放O2

Note:口服/注射BPG无效(磷酸糖不能穿过细胞膜)48正常成熟红细胞(HbA)外形均一镰形贫血病的红细胞(HbS)外形多变，长而僵硬，不易通过毛细血管，而且很容易破裂及凝集7-18⑷镰形细胞贫血病是一种分子病JamesHerrick1861-1954

-最初于1904年在芝加哥的一名严重贫血的黑人大学生体内发现：Herrick'ssyndrome-V.Mason于1922年定名为

sicklecellanemia，但错误地认为是由显性基因造成的49-LinusPauling等(1940s)采用电泳法将HbA与

HbS成功分离，首次揭示出遗传性疾病的分子基础，并进而证实了该病的隐性遗传特性HbS携带的正电荷要比HbA的更多-VernonIngram等(1956)在氨基酸序列分析中进一步发现，正是链的Glu6th被

Val所替换导致了HbA转变成HbS，而这一致命的替换最终被证实是由编码该链的基因中单个核苷酸的突变所引发

(GAA/GGUA/G)1924-50-脱氧HbS纤维结构Val残基侧链脱氧HbS在纤维中的排列(仅显示3个亚基)HbS1的Val侧链嵌入HbS2中由PheF1(85)和LeuF4(88)残基形成的疏水口袋，而后者在R态中几乎不存在V7-17g51突起加大容易相互凝集7-19直径~220Å-脱氧HbS纤维的形成52一、选择2,3,5,8,9,11,16,21二、填空3,5,8,11,15四、判断5,11~13,20,21,30,31五、简答与论述4,5,8复习题p28~33:p38~41:一、选择1~3二、填空2,5四、判断4,7,14五、简答与论述7作业1)多肽链片段是在疏水还是亲水环境中更利于

-螺旋的形成？为什么？2)简述牛胰核糖核酸酶(RNaseA)变性-复性经典实验。该实验说明了什么问题？3)以Hb为例简述蛋白质结构与其功能之间的相互关系自学第四节：蛋白质分离纯化与鉴定53

字陶民，中国现代生物化学家及营养学家。1893年11月24日生于福建省福州市，1959年8月8日卒于美国马萨诸塞州的波士顿城；终生保持中国为其唯一的