第四章分子生物学研究方法课件

2024/10/301第七章分子生物学研究方法第一节重组DNA技术回顾第二节DNA基本操作技术第三节RNA基本操作技术第四节SNP的理论与应用第五节基因克隆技术第六节蛋白质组与蛋白质组学技术2024/10/302第一节重组DNA技术回顾一、重组DNA技术发展史上的重大事件第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者：即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；

2024/10/303第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题；

第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。2024/10/304但是：当时由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。随着DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。2024/10/305重组DNA技术（recombination）：

是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。2024/10/306工具酶：

限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）

DNA连接酶（DNAligase）工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。2024/10/307（一）限制性内切酶(RE)

1、概念：一类能识别和切割双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶。

2、分类：

I型、II型、Ⅲ型2024/10/308

类型II：识别位点和酶切位点一致，具特异性。单体酶，性质稳定，Mg2+为辅助因子。目前已分离了数百种。

类型I：识别的DNA序列长约十几个bp；酶切位点在距识别位点1kb左右处随机切割，非特异性；复合酶，无使用价值。

类型Ⅲ：酶切位点在识别位点下游24-26bp处，非特异性。单体酶，如HgaI:GACGCnnnnn2024/10/3093、II型限制性内切酶的基本特性5’…GCTGAATTCGAG…3’3’

…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点(1)识别dsDNA分子中4～8bp的特定序列(2)大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧(3)识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构2024/10/3010EcoRI等产生的5‘粘性末端

5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’

EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’

退火4-7℃5‘…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’

POH2024/10/3011（二）DNA连接酶(ligase)

将两段DNA片段连接起来的酶称为DNA连接酶。1、E.coliDNAligase:连接粘端,催化需要NAD+参与2、T4DNAligase:连接粘端和平端，催化需要ATP参与都不连接单链2024/10/3012DNA连接酶的基本性质修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键

nickOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’POHDNA连接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’2024/10/3013二、基因克隆的载体克隆用载体：是指具备自我复制能力的DNA分子。常见的分子克隆载体有：病毒、噬菌体、质粒。克隆用载体的选择具备复制原点，能够自我复制具备适合的酶切位点，且不在原点具有筛选指标对抗菌素的抗性基因产物的显色反应2024/10/3014载体的功能

运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件2024/10/3015三、基因克隆的操作

1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子；2024/10/30163、感受态细胞的制备—氯化钙法第一次摇菌第二次摇菌离心收集细菌0.1MCaCl2重悬细胞,冰浴30min离心、重悬重复一次2024/10/30174、转化（transformation）

感受态细胞与连接产物轻轻混匀,冰浴30min，42℃水浴热激60–90s，快速冰浴2min加液体LB振荡培养，使细胞复苏。2024/10/30185、筛选（screening）①根据重组载体的表型

抗药性（Ampr

、Tetr）

其他mark（

-互补筛选）②根据DNA限制酶的酶谱分析③

PCR反应2024/10/3019基因克隆流程示意图2024/10/3020

带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。一、核酸的凝胶电泳（一）基本原理：第二节DNA基本操作技术2024/10/3021电泳迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度。与电场强度和电泳分子所带的净电荷成正比。与分子的摩擦系数成反比，摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。支持介质：稳定，无反应活性；2024/10/3022（二）种类

1)按凝胶材料分:聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳

2)按电泳装置分:水平式/琼脂糖凝胶;竖式/聚丙烯酰胺凝胶

3)两种方法比较：分离效果和分离范围;操作难易2024/10/3023琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是从红色海藻产物琼脂中提取的一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉未加热到溶点后凝固，便会形成良好的介质，其密度由琼脂糖的浓度所决定。特点：分辨能力低，但应用范围广，适用于较大分子的分析。适于分离200bp~50kb的DNA片段。操作简便。2024/10/30242024/10/3025聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂TEMED(四甲基乙二胺）的作用下聚合而成。

聚合时，由单体丙烯酰胺聚合成链状物，由交联剂甲叉双丙烯酰胺将链与链交联成网状，形成立体的不溶于水的凝胶。2024/10/3026特点：分辨能力高，但应用范围小，适用于较小分子的分析。适于分离5bp~500bp的DNA片段。操作复杂。核酸分子的染料

溴化乙锭（EB），因具有扁平分子的空间结构，能插入到DNA分子或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下发出荧光。2024/10/3027（三）

用途

琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规分析；聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。（四）

凝胶电泳的一般程序制胶点样电泳染色观察2024/10/30282024/10/30292024/10/3030二、细菌转化细菌转化（transformation）是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化的DNA菌株叫供体菌株，接受转化的DNA菌株叫受体菌株。目前常用的转化方法有CaCl2法(化学转化法)和电转化法。2024/10/3031感受态细胞的制备—氯化钙法第一次摇菌第二次摇菌离心收集细菌0.1MCaCl2重悬细胞,冰浴30min离心、重悬重复一次2024/10/3032转化（transformation）

感受态细胞与连接产物轻轻混匀,冰浴30分钟，42℃水浴热激60–90秒，快速冰浴2分钟加液体LB振荡培养，使细胞复苏。2024/10/3033三、PCR基因扩增

聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）,随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖。2024/10/3034

PCR特异性，即所扩增片段是由两个人工合成的引物序列决定的。2024/10/3035PCR反应原理①变性②退火③延伸2024/10/3036反应体系的成分耐热的DNA聚合酶PCR反应的缓冲液Mg2+Tris•

Cl

引物dNTP模板DNA2024/10/3037温度循环参数

变性：双链DNA分子加热分离成两条单链DNA分子的过程。变性温度：是指双链DNA分子50％发生变性时的温度，一般为94∽95℃2024/10/3038

退火：两引物分别与两条DNA的两侧序列特异性互补，形成双链的过程称为退火。退火温度一般在50∽65℃之间，具体温度与引物长度、碱基组成以及浓度有关。2024/10/3039

延伸：在适宜条件下，DNA聚合酶以单链DNA为模板，以4种脱氧核苷三磷酸（dNTP)为底物,在引物的诱导下，按5′→3′方向复制互补DNA的过程。延伸温度一般为70∽75℃，此时DNA聚合酶活性最高。2024/10/3040时间参数

变性时间：决定于DNA的复杂性，一般选取94℃1min,因过长的高温时间，会降低DNA聚合酶的活性；

退火时间：一般情况下取30s~1min，因为引物比较短；

延伸时间：根据扩增片段的长度而定，一般在1kb以内的片段需延伸1min,更长的片段需相应延长时间。

2024/10/3041引物1、引物长度在15∽30bp之间，引物的退火温度Tm=4(G+C)+2(A+T)2、碱基随机分布避免一连串相同碱基，引物本身不应存在互补序列，两条引物间也不应有互补性，尤其是3′端；2024/10/30423、G+C含量

G+C含量一般为40％∽60％4、引物3′端碱基的特异性。2024/10/3043PCR技术的特点：第一，特异性强第二，效率高第三，灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞第四，对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA2024/10/30442024/10/3045四、实时定量PCR

实时定量PCR技术：指利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的累积速率绘制动态变化图，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，从而测定终端产物的丰度。2024/10/3046

荧光探针事先混合在反应管中，只有与DNA结合后才能被激发出荧光。2024/10/30475’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’Repeat非序列特异性的DNA结合的荧光探针BDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll与双链DNA结合；与DNA结合后才发出荧光。2024/10/3048特异性的荧光探针

特异性的荧光探针是把荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的DNA探针。通过探针与PCR产物特异性的结合，在PCR过程中可对产物实现实时、定量检测。2024/10/3049

TaqMan探针是一小段被设计成可以与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA（一般为5~50bp），并且该单链DNA的5’和3’端带有短波长和长波长两个不同荧光基团。2024/10/3050

当探针单独存在时，由于荧光共振能量转移的作用而发生荧光猝灭。在PCR过程中，由于TaqDNA酶的5’-3’外切酶活性的作用，使探针的5’端的基团被切断，加大了荧光基团间的的距离，被切下来的荧光基团恢复荧光。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此，Taqman探针检测的是积累荧光。5’5’3’3’d.NTPsThermalStableDNAPolymerasePrimers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AddMasterMixandSampleDenaturation5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’AnnealingReactionTubeTaql5’3’RQProbe5’3’RQ应用TaqMan探针的实时定量PCR技术5’3’5’3’5’3’RQ5’3’Taq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’5’3’QTaqR3’5’5’3’3’QTaqR5’lR2024/10/3053实时定量PCR的绝对定量Ct值：指PCR扩增过程中，扩增产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。2024/10/3054

模板起始浓度越高，Ct值越小

Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系Ct值与模板起始浓度的关系

如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度。

（图5-11）相对定量（两个样本中的基因表达水平进行比较）

（图5-12）2024/10/3056五、基因组DNA文库构建

是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。2024/10/3057基因组DNA文库的类型根据所选用的载体可以分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。2024/10/3058基因组DNA文库的质量标准一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力;载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆;克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序;克隆片段易于从载体分子上完整卸下;重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。2024/10/3059基因组DNA文库构建的程序①载体DNA的制备；②基因组DNA的提取；③基因组DNA的部分酶切、分离与回收；④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤重组克隆的挑选和保存。2024/10/30602024/10/3061第三节RNA基本操作技术一、总RNA的提取液氮研磨组织、匀浆加入Trizol试剂（异硫氰酸胍-苯酚）溶解细胞氯仿抽提异丙醇沉淀溶解在变性条件下采用电泳方法对其进行检测2024/10/3062二、mRNA的纯化

大部分真核生物的mRNA有3’poly（A）尾巴

oligo(dT)能与poly(A)尾巴互补，由此来获得mRNA。AAAAAAAAAAn5’cap2024/10/30632024/10/3064分离mRNA的试剂盒可应用PromegaPolyATtractmRNA分离系统分离poly(A)mRNA。将用生物素标识的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。2024/10/3065三、cDNA的合成

可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；

应选用活性较高的反转录酶（Reversetranscriptase）；

应选用甲基化dCTP(防止被限制性内切酶切割)；

应保证所获得双链cDNA的方向性(cDNA两端加上不同内切酶所识别的接头序列);

因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5’-methylC的外源DNA，所以，应选用mcrA-,mcrB-菌株。2024/10/30662024/10/3067定向cDNA的合成及分子修饰2024/10/3068四、cDNA文库

将某种细胞的全部mRNA通过逆转录合成cDNA，与载体连接，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为cDNA文库。cDNA文库具有组织细胞特异性。构建cDNA文库，材料来自mRNAcDNA文库只含有mRNA的分子结构,不含真核基因的间隔序列和调控区。2024/10/3069cDNA文库的特点：①出发材料是一定时空条件下的细胞总mRNA,在转录水平上反映生物在特定发育时期、特定组织(或器官)在一定环境条件下的基因表达情况。②不同组织、细胞在不同时段的mRNA种类不同(即基因的表达谱不同)，同种生物的cDNA文库有组织细胞的界定，如肝组织或胚胎组织。2024/10/3070分离纯化目的基因

目的基因+vector=重组DNA分子2024/10/3071噬菌粒的包装

含有cDNA插入片段的重组噬菌粒只有经过体外蛋白外壳包装反应，才能成为具有侵染和复制能力的成熟噬菌体。2024/10/3072与载体连接成重组DNA侵染大肠杆菌进行克隆合成双链DNA逆转录生成cDNA从细胞中分离出mRNA逆转录酶DNA聚合酶噬菌粒的包装2024/10/3073五、基因文库的筛选1、核酸杂交法平板上的菌落转移硝酸纤维素膜温育碱变性用蛋白酶K去除蛋白质形成菌落DNA印迹80℃烘烤滤膜DNA固定与探针杂交检测杂交结果2024/10/30742、PCR筛选法1）、设计特异性引物；2）、将文库保存在多孔培养板上，对每个孔进行PCR扩增；3）、对阳性孔进行稀释至次级孔，再对每个孔进行PCR扩增，直至鉴定出与目的基因对应的单克隆。2024/10/30753、免疫筛选法适用范围：表达文库用某个基因产物的特异性抗体对重组克隆进行筛选。文库铺于平板转移至NC保存原板,λ噬菌体表达加入一抗洗去一抗,加入二抗加底物显色从保存板中挑出阳性菌落2024/10/30762024/10/3077第四节SNP理论及应用

SNP，中文翻译为单核苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。SNP转换（2/3）：C→T，A→G颠换（1/3）：C→A，G→T，C→G，A→T位置基因编码区（cSNP)基因周边区（pSNP)基因间（iSNP)同义cSNP非同义cSNP2024/10/3078SNP的检测技术1、基因芯片技术概念：就是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。2024/10/3079基因芯片的工作原理：应用已知核酸序列作为靶基因与互补的探针核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。具体操作:①将许多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作为靶基因，有规律地排列固定于支持物上；②样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子或放射性同位素作为探针；2024/10/3080③然后按碱基配对原理将两者进行杂交;④再通过荧光或同位素检测系统对芯片进行扫描，由计算机系统对每一探针上的信号作出比较和检测，从而得出所需要的信息。2024/10/30812、Taqman技术

在反应体系中加入2种不同荧光标记的探针，这两个探针分别与两个等位基因完全配对。探针设计运用了荧光共振能量转移；

Taq酶5'→3'外切酶的活性；通过不同荧光值的变化，对基因型进行分型。2024/10/30823、分子信标（MolecularBeaconProbe）是一种呈环状结构的荧光标记的寡核苷酸，环状区与靶序列特异性结合，茎干区由5~8个碱基对组成，5'端带有荧光发生基团，3'端带有荧光猝灭基团。2024/10/3083RQQRExcitation分子信标（MolecularBeaconProbe）2024/10/30844、焦磷酸测序法是一种短片段焦磷酸测序技术，在测序引物的引导下，完成短片段（含SNP）的测序，从而实现基因分型。缺点：不能检测长片段，对于重复序列没有办法。2024/10/3085原理:生成1分子dNTP加入1分子PPi与APS反应ATP硫酸化酶的作用下生成ATP使萤光素氧化萤光素生成双磷酸酶降解2024/10/3086原理1、测序引物与PCR扩增的单链DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育。2、4种dNTP之一被加入反应体系，如与模板配对，此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。而且释放出来的PPi的量与和模板结合的dNTP的量成正比。2024/10/30873、ATP硫酸化酶在5’-磷酰硫酸腺苷(

adenosine5´phosphosulfate,APS）存在的情况下催化PPi形成ATP，ATP驱动萤光素酶介导的萤光素向氧化萤光素的转化，氧化萤光素发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由相应的软件反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。2024/10/30884、ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。5、然后加入下一种dNTP。最终待测序列的顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。

在体系中使用的是dATPS而非dATP，因为dATPS不是荧光素酶的底物，而且DNA聚合酶对dATPS的催化效率更高。2024/10/3089SNP的应用1、人类基因单倍型图的绘制；2、SNP与人类疾病易感基因的相关性分析；3、指导用药与药物设计。2024/10/3090第五节基因克隆技术克隆