流式细胞仪基本结构工作原理和应用课件

流式细胞仪基本结构工作原理和应用流式细胞仪的结构，工作原理和应用概况流式细胞仪基本结构工作原理和应用-2-流式细胞仪和流式细胞术－概述流式细胞仪的基本结构和工作原理流式细胞仪的测量参数和检测指标流式细胞仪获取的数据和分析方法流式细胞仪在生物医学基础研究中的应用流式细胞仪在临床检测和科研中的应用流式细胞仪的结构、工作原理和应用概况流式细胞仪基本结构工作原理和应用-3-一、流式细胞仪和流式细胞术－基本概念流式细胞仪(FlowCytometer，FCM):

是集合光电子物理，光电测量技术，液流技术，计算机技术等现代高科技技术为一体的测量和分析细胞的仪器。流式细胞术(FlowCytometry，FCM):

是应用流式细胞仪，对处于快速流动液体中的细胞或生物颗粒进行“多参数快速测量”和“定量分析”，以及“分选细胞”的技术。流式细胞仪基本结构工作原理和应用-4-一、流式细胞仪和流式细胞术－基本概念流式细胞仪和流式细胞术的特点可多参数（散射光和多种荧光）测量和分析；可快速测量和分析：每秒可达1000-10000个细胞。分选细胞的纯度高：目的细胞纯度可达99%以上。获取的数据分析结果更具有统计学意义；对检测样本要求：待测细胞必须是单个细胞悬液。

(组织块样品需制备成单细胞悬液）流式细胞仪基本结构工作原理和应用-5-台式机——FACSCalibur双激光

488nm 635nm四色荧光（6参数）分选细胞

300个∕每秒

效率很低（基本不用）流式细胞仪基本结构工作原理和应用-6-流式细胞仪基本结构工作原理和应用-7-台式分选机——FACSAria双激光–三激光

488nm 633nm407nm7色～13色荧光高速分选细胞

30000个细胞∕每秒流式细胞仪基本结构工作原理和应用-8-大型机——FACSVantageSE多激光多波长八荧光参数

高速分选单细胞点对点分选流式细胞仪基本结构工作原理和应用-9-流式细胞仪基本结构工作原理和应用-10-流式细胞仪基本结构工作原理和应用-11-流式细胞仪和流式细胞术－概述流式细胞仪的基本结构和工作原理流式细胞仪的测量参数和检测指标流式细胞仪获取的数据和分析方法流式细胞仪在生物医学基础研究中的应用流式细胞仪在临床检测和科研中的应用流式细胞仪的结构、工作原理和应用概况流式细胞仪基本结构工作原理和应用-12-二、流式细胞仪的基本结构和工作原理光路系统：

激光光源，光路系统（透镜、滤光片）电子系统：光电倍增管（PMT），补偿电路液流系统：

鞘液系统，样品流动系统数据系统：计算机，数据测量和分析软件。细胞分选系统（一）流式细胞仪的结构

流式细胞仪基本结构工作原理和应用-13-流式细胞仪－光路系统激光(Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照激光波长:488nm,635nm光收集系统是由若干组透镜,滤波片,小孔组成，将产生的光信号引导至检测器流式细胞仪基本结构工作原理和应用-14-光路系统流式细胞仪基本结构工作原理和应用-15-InjectorTip流式细胞仪基本结构工作原理和应用-16-InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流式细胞仪基本结构工作原理和应用-17-流式细胞仪－光学系统激发光源与荧光标记物流式细胞仪基本结构工作原理和应用-18-光学检测信号流式细胞仪基本结构工作原理和应用-19-流式细胞仪的光学系统FACSCalibur流式细胞仪基本结构工作原理和应用-20-流式细胞仪－液流系统流式细胞仪基本结构工作原理和应用-21-液流系统：鞘液系统＋样品流动系统流式细胞仪基本结构工作原理和应用-22-

流式细胞仪的电子系统

信号检测和分析当细胞携带荧光素,通过激光照射区,受到激发产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号荧光信号由光电接收器接收，转变为电脉冲信号，电脉冲信号经A/D转换成数字信号数字信号传送到计算机，进行储存、作图和统计分析流式细胞仪基本结构工作原理和应用-23-

数据系统流式细胞仪基本结构工作原理和应用-24-流式细胞仪和流式细胞术－概述流式细胞仪的基本结构和工作原理流式细胞仪的测量参数和检测指标流式细胞仪获取的数据和分析方法流式细胞仪在生物医学基础研究中的应用流式细胞仪在临床检测和科研中的应用流式细胞仪的结构、工作原理和应用概况流式细胞仪基本结构工作原理和应用-25-三、流式细胞仪的测量参数和检测指标流式细胞仪可检测的参数1：光学参数(1)散射光信号。前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射光的前向(５°)散射光信号,可反映：细胞相对大小及其表面积

侧向角散射光（SSC,SideScatter）

入射光90°角的散射光信号，可反映：细胞颗粒性程度（胞内成分和构造和表面结构的复杂性）流式细胞仪基本结构工作原理和应用-26-（二）流式细胞仪可检测的参数1：光学参数

(1).

散射光信号前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

入射光的前向

(５°)散射光信号,

可反映：细胞相对大小及其表面积侧向角散射光（SSC,SideScatter）

入射光90

角的散射光信号，

可反映：细胞颗粒性程度

（胞内成分和构造和表面结构的复杂性）流式细胞仪基本结构工作原理和应用-27-散射光信号前向角散射光－FSC:

可以反映细胞相对大小的参数FALSSensorLaser流式细胞仪基本结构工作原理和应用-28-散射光信号侧向角散射光－SSC：

可以反映细胞颗粒性程度的参数（与胞内部结构复杂性及膜表面有关）FALSSensor90LSSensorLaser流式细胞仪基本结构工作原理和应用-29-流式细胞的基本信息:“形态”流式细胞仪基本结构工作原理和应用-30-流式细胞仪基本结构工作原理和应用-31-外周全血细胞（红细胞溶解后）以散射光

（FSC/SSC)

表示的双参数点陈图（dotplot）流式细胞仪基本结构工作原理和应用-32-外周全血细胞（红细胞溶解后）以散射光

（FSC/SSC)

表示的双参数点陈图（dotplot）流式细胞仪基本结构工作原理和应用-33-（二）流式细胞仪检测的参数1:光学参数

(2).

特征信息－荧光（Fluorescence）信号荧光素吸收激光（激发光波长）能量荧光素将吸收能量释放，转换为释放较入射光波长更长的光量子（发射光波长）荧光素与特异抗体结合（荧光抗体）荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生荧光信号越强 荧光素与细胞核酸结合，荧光强度反映核酸含量荧光素与细胞蛋白结合，荧光强度反映细胞蛋白含量流式细胞仪基本结构工作原理和应用-34-（二）流式细胞仪检测的参数1:光学参数

(2).

特征信息－荧光（Fluorescence）信号Forwardscatter(FSC)Sidescatter(SSC)FL1（第一荧光）-FITC(异硫氰酸荧光素）FL2（第二荧光）-PE（藻红蛋白）FL3（第三荧光）-PerCP,PeCy5等PL4（第四荧光）-APC（别藻蓝蛋白）流式细胞仪基本结构工作原理和应用-35-荧光信号FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)流式细胞仪基本结构工作原理和应用-36-流式细胞仪基本结构工作原理和应用-37-OpticalFiltersDichroicFilter/Mirrorat45degReflectedlightTransmittedLightLightSource流式细胞仪基本结构工作原理和应用-38-StandardBandPassFiltersTransmittedLightWhiteLightSource630nmBandPassFilter620-640nmLight流式细胞仪基本结构工作原理和应用-39-StandardLongPassFiltersTransmittedLightLightSource520nmLongPassFilter>520nmLightTransmittedLightLightSource575nmShortPassFilter<575nmLightStandardShortPassFilters流式细胞仪基本结构工作原理和应用FACSCalibur的滤光片系统FL1：530/30BP:FITCFL2：585/42BP:PEFL3：670LP:PeCy5,PeCy5.5,PerCPFL4:661/16BP:APC流式细胞仪基本结构工作原理和应用-41-PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersFlowCytometryOpticsLaser1234Flowcell流式细胞仪基本结构工作原理和应用-42-EthidiumPEcis-ParinaricacidTexasRedPE-TRConj.PIFITC600nm300nm500nm700nm400nm457350514610632488CommonLaserLine流式细胞仪基本结构工作原理和应用-43-Fluoresceinisothiocyanate(FITC)

（异硫氰酸荧光素）400nm500nm600nm700nmWavelengthProteinExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm流式细胞仪基本结构工作原理和应用-44-ExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmPhycoerytherin(PE),藻红蛋白)Protein流式细胞仪基本结构工作原理和应用-45-PropidiumIodide(PI),(碘化丙锭)400nm500nm600nm700nmPIDNAExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm流式细胞仪基本结构工作原理和应用-46-Allophycocyanin(APC)Protein632.5nm(HeNe)ExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nm流式细胞仪基本结构工作原理和应用-47-ProbeEx(nm)Em(nm)MWNotesHydroxycoumarin325386331SuccinimidylesterAminocoumarin350445330SuccinimidylesterMethoxycoumarin360410317SuccinimidylesterCascadeBlue375;400423596HydrazideLuciferyellow425528

NBD466539294NBD-XR-Phycoerythrin(PE)480;565578240,000

PE-Cy5conjugates480;565;650670

akaCychrome,R670,Tri-Color,QuantumRedPE-Cy7conjugates480;565;743767

Red613480;565613

PE-TexasRedFluorescein495519389FITC;pHsensitiveBODIPY-FL503512

Cy3512;552565,615

TRITC547572444TRITCX-Rhodamine570576548XRITCLissamineRhodamineB570590

PerCP490675

PeridininchlorphyllproteinTexasRed589615625SulfonylchlorideCy5625-650670

Cy77437671,001

Allophycocyanin(APC)650660104,000

TruRed490,675695

PerCP-Cy5.5conjugateAPC-Cy7conjugates650;755767

PharRed流式细胞仪基本结构工作原理和应用-48-荧光信号双色直接染色流式细胞仪基本结构工作原理和应用-49-Compensation（补偿）流式细胞仪基本结构工作原理和应用-50-Compensation

（补偿）流式细胞仪基本结构工作原理和应用-51-Compensation

（补偿）流式细胞仪基本结构工作原理和应用-52-（二）流式细胞仪可检测的参数2:细胞参数细胞结构细胞大小细胞颗粒性程度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量细胞功能细胞表面蛋白抗原细胞胞浆内蛋白性抗原细胞内细胞因子细胞增殖细胞内钙离子浓度二、流式细胞仪的工作原理和测量参数流式细胞仪基本结构工作原理和应用-53-流式细胞仪和流式细胞术－概述流式细胞仪的基本结构和工作原理流式细胞仪的测量参数和检测指标流式细胞仪获取的数据和分析方法流式细胞仪在生物医学基础研究中的应用流式细胞仪在临床检测和科研中的应用流式细胞仪的结构、工作原理和应用概况流式细胞仪基本结构工作原理和应用-54-四、流式细胞仪获取的数据和分析方法流式细胞仪和流式细胞术的特点可多参数（散射光和多种荧光）测量和分析；可快速测量和分析：每秒可达1000-10000个细胞。是单个细胞悬液。流式细胞仪基本结构工作原理和应用-55-（三）流式细胞仪分析数据及常见图形：数据存储:LISTMODE数据显示:

二维点图(DotPlot)

直方图(Histogramplot)

等高线图(ContourPlot)

密度图(Densityplot)等流式细胞仪基本结构工作原理和应用-56-（三）流式细胞仪分析数据常见图形：

1.（二维）点陈图/散点图(DotPlot)适用于：双参数分析流式细胞仪基本结构工作原理和应用-57-（三）流式细胞仪分析数据常见图形：点图分析(dotplot)流式细胞仪基本结构工作原理和应用-58-（三）流式细胞仪分析数据常见图形：

2.直方图(HistogramPlot)适用于：单参数分析流式细胞仪基本结构工作原理和应用-59-（三）流式细胞仪分析数据常见图形直方图分析(histogram)流式细胞仪基本结构工作原理和应用-60-（三）流式细胞仪分析数据常见图形：等高图和密度图分析(densityplot)流式细胞仪基本结构工作原理和应用-61-散点图

密度图二维等高图直方图图报告中常见的几种流式细胞图流式细胞仪基本结构工作原理和应用-62-图双标记分析小鼠脾细胞中T细胞亚群流式细胞仪基本结构工作原理和应用-63-流式细胞术检测细胞的荧光标记方法单标：

一种单抗:FL1,FSC,SSC（三参数）双标：两种单抗：FL1,FL2,FSC,SSC（四参数）三标：三种单抗：FL1,FL2,FL3,FSC,SSC（五参数）四标－四种荧光标记抗体：四种单抗：FL1,FL2,FL3,FL4,FSC,SSC（六参数）流式细胞仪基本结构工作原理和应用-64-流式细胞仪应用软件主软件：

CELLQuest：样本获取，数据分析仪器校正软件：

FACSComp：仪器自动校准，设定实验分析条件临床应用自动软件：

SimulSET/MultiSET：淋巴细胞亚群计数分析，可报告T淋巴细胞（T辅助细胞、T抑制细胞）、B淋巴细胞、NK淋巴细胞含量，还可以报告绝对计数

ProCOUNT：干细胞计数分析，报告CD34+细胞绝对值HLA-B27：自动测定全血HLA-B27

Retic-COUNT：网织红细胞计数

流式细胞仪基本结构工作原理和应用-65-流式细胞仪应用软件CellQuest，BD公司FACS系列仪器系统操作和分析软件流式细胞仪的各种工作状态设定，功能控制，样品检测，获取和储存数据文件，样品数据文件的数据分析等功能，是流式细胞仪技术的主要系统软件。只能在苹果机计算机（Machintoshi）上使用。

ModFit：DNA周期分析，检查细胞周期分析，染色体倍体性分析（肿瘤细胞），以及细胞凋亡和增殖的分析。WinMDI：用共享软件，可以对流式细胞仪数据文件进行多参数分析，分析功能与CellQuest软件基本相同，

可在PC机的Windows界面下使用。

流式细胞仪基本结构工作原理和应用-66-流式细胞仪和流式细胞术－概述流式细胞仪的基本结构和工作原理流式细胞仪的测量参数和检测指标流式细胞仪获取的数据和分析方法流式细胞仪在生物医学基础研究中的应用流式细胞仪在临床检测和科研中的应用流式细胞仪的结构、工作原理和应用概况流式细胞仪基本结构工作原理和应用-67-五、流式细胞术在生物医学基础研究中的应用流式细胞仪和流式细胞术的特点可多参数（散射光和多种荧光）测量和分析；可快速测量和分析：每秒可达1000-10000个细胞。细胞悬液。流式细胞仪基本结构工作原理和应用-68-淋巴细胞亚群分析细胞凋亡

肿瘤学移植免疫三流式细胞仪在临床检测和科研中的应用血小板其它流式细胞仪基本结构工作原理和应用-69-淋巴细胞亚群分析流式细胞仪基本结构工作原理和应用-70-AdhesionMetabolic流式细胞仪基本结构工作原理和应用-71-流式细胞仪基本结构工作原理和应用-72-流式细胞仪基本结构工作原理和应用-73-淋巴细胞亚群检测意义疾病机理研究

疾病辅助诊断移植后免疫检测治疗方案的确定及疗效评价CD25高于正常值5-10%,表明即将或已发生排斥CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染

<0.2时,必须停用免疫抑制剂CD2+HLA-DR+增加5-10%,且不伴有CD25的增加,提示巨细胞病毒感染慢性疲劳,感染后综合征,纤维肌痛,类风湿性关节炎,过敏等

疾病预防流式细胞仪基本结构工作原理和应用-74-流式细胞仪和流式细胞术－概述流式细胞仪的基本结构和工作原理流式细胞仪的测量参数和检测指标流式细胞仪获取的数据和分析方法流式细胞仪在生物医学基础研究中的应用流式细胞仪在临床检测和科研中的应用流式细胞仪的结构、工作原理和应用概况流式细胞仪基本结构工作原理和应用-75-五、流式细胞术在临床检测和科研中的应用流式细胞仪和流式细胞术的特点可多参数（散射光和多种荧光）测量和分析；可快速测量和分析：每秒可达1000-10000个细胞。分选细胞的纯度高可达99%以上。。流式细胞仪基本结构工作原理和应用-76-淋巴细胞亚群检测意义

Control（n=20)ActiveSLE(n=17)StableSLE(n=13)CD370.4±5.8765.8±10.968.5±8.95CD435.0±5.7022.1±4.15**34.5±4.23CD827.9±5.7345.7±9.58**32.7±9.01CD4/CD81.27±0.140.43±0.12**1.05±0.26*NK17.8±5.484.37±3.31**7.59±5.01**鉴别活动期和非活动期SLE流式细胞仪基本结构工作原理和应用-77-HIVANDAIDS流式细胞仪基本结构工作原理和应用-78-Th1/Th2细胞流式细胞仪基本结构工作原理和应用-79-Th1/Th2细胞Th1型细胞因子介导细胞免疫反应引起迟发型过敏反应、巨噬细胞活化、局部炎症刺激来源：病毒、某些细菌Th2型介导体液免疫反应引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、促进I型变态反应（过敏反应）刺激来源：多细胞寄生虫、过敏原流式细胞仪基本结构工作原理和应用-80-Th1/Th2细胞PMA+Ionomycin刺激4-6hr流式细胞仪基本结构工作原理和应用-81-四色标记胞内因子FCM检测流式细胞仪基本结构工作原理和应用-82-流式细胞仪检测胞内细胞因子

新鲜分离PBMC

加PMA＋Io刺激后6h测定胞内细胞因子IL-4和IFN-g

检测免疫细胞表型和结合检测胞内细胞因子：操作和分析方法；

流式细胞仪基本结构工作原理和应用-83-Th1/Th2失衡相关疾病变应性疾病

变应性哮喘,

春季结膜炎炎性和自身免疫性疾病

系统性红斑狼疮类风湿性关节炎自身免疫性甲状腺疾病银屑病(牛皮癣)IgA肾病多发性硬化流式细胞仪基本结构工作原理和应用-84-肿瘤学流式细胞仪基本结构工作原理和应用-85-肿瘤发生发展流式细胞仪基本结构工作原理和应用-86-细胞周期G1MG2SQuiescentcellsG0流式细胞仪基本结构工作原理和应用-87-G2MG0G1s0

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle

流式细胞仪基本结构工作原理和应用-88-ADNAhistogramG0-G1SG2-MFluorescenceIntensityCellNumber流式细胞仪基本结构工作原理和应用-89-DDM检查——区分双粘体细胞流式细胞仪基本结构工作原理和应用-90-AtypicalDNAHistogramG0-G1SG2-MFluorescenceIntensity#ofEvents流式细胞仪基本结构工作原理和应用-91-0

200

400

600

8001000PI荧光强度(DNA含量)DNA含量分析2N4NCountsG0/G1G2/MS异倍体流式细胞仪基本结构工作原理和应用-92-MultiparametergatingHumanProstatetumorcelllineDU-145DNA-HoechstCyclin-B1-FITCP-105Cy5EndoduplicatingpopulationMitoticcellsDNA-HoechstR1-gateDatafromDr.JamesJacobberger流式细胞仪基本结构工作原理和应用-93-0

200

400

600

8001000PIFluorescenceDNA

Analysis2N4N02004006008001000PIFluorescenceDNAAnalysisAneuploidpeak流式细胞仪基本结构工作原理和应用-94-DNA含量分析70%人类癌症中存在着异倍体或细胞周期的改变DNA倍体和S期比例--指导治疗[2]卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，原发部位不明的癌症--早期(I/II期)DNA倍体和DNA指数--预后长期和无病生存期[2]卵巢癌--晚期流式细胞仪基本结构工作原理和应用-95-P53/Bcl-2流式细胞仪基本结构工作原理和应用-96-P53乳腺癌

与病理学分级有关,并与乳腺癌的淋巴结转移显著相关大肠肿瘤

早期发现大肠癌胃癌

与预后相关肝细胞癌

与组织分级,肿瘤预后,转移及肿瘤大小密切相关流式细胞仪基本结构工作原理和应用-97-Bcl-2Bcl-2在正常组织中的表达

造血系统细胞—淋巴,单核细胞等受激素或生长因子调节的腺上皮—前列腺上皮,子宫内膜等干细胞或增值细胞—皮肤的基底细胞,肠上皮寿命长的分裂细胞—神经元胚胎组织Bcl-2在肿瘤组织中的表达

肾脏肿瘤—肾癌,肾盂乳头瘤,Wilms瘤,肾嗜酸细胞瘤前列腺癌

B细胞性淋巴瘤乳腺癌(43%)

甲状腺癌流式细胞仪基本结构工作原理和应用-98-nm23nm23与多种肿瘤的转移及预后相关

肝细胞癌甲状腺肿瘤乳腺癌结肠癌肉瘤流式细胞仪基本结构工作原理和应用-99-CD44(CD44s/CD44v)流式细胞仪基本结构工作原理和应用-100-CD44(CD44s/CD44v)

nExpressionofCD44v6-～+++～+++Lymphnodemetastasis

With247(29.1%)17(70.9%)##

Without3624(66.7%)12(33.3%)DukesstageA107(70.0%)3(30.0%)B2214(63.6%)8(36.4%)C166(37.5%)10(62.5%)**D124(33.3%)8(66.7%)**CD44v6与大肠癌流式细胞仪基本结构工作原理和应用-101-肿瘤多药耐药性(MDR)检测P-gp在肿瘤组织中的表达

乳腺癌,膀胱癌,胃癌,食管癌,卵巢癌,前列腺癌等化疗前高表达化疗后高表达

肾细胞癌,结肠癌,肝癌,肾上腺皮质癌,胰腺癌等化疗前低表达

非何杰金氏淋巴瘤,成神经细胞瘤,急性髓白血病等化疗不敏感化疗敏感化疗不敏感流式细胞仪基本结构工作原理和应用-102-乳腺癌石蜡切片脱腊ER(雌激素受体)ER抗体染色酶解流式检测固定(多聚甲醛)破膜(70%甲醇)细胞流式细胞仪基本结构工作原理和应用-103-Cyclin(细胞周期蛋白)流式细胞仪基本结构工作原理和应用-104-细胞凋亡流式细胞仪基本结构工作原理和应用-105-DNA断裂流式细胞仪基本结构工作原理和应用-106-Fas/FasL(CD95/CD95L)T细胞与T细胞之间的凋亡T淋巴细胞与靶细胞间的凋亡靶细胞与靶细胞之间的凋亡流式细胞仪基本结构工作原理和应用-107-乳腺癌Fas/FasL与疾病慢性病毒性肝炎恶性肿瘤细胞-黑色素瘤、结肠癌、肺癌、肝癌等脑缺血后细胞凋亡自身免疫性疾病—系统性红斑狼疮Fas/FasL(CD95/CD95L)流式细胞仪基本结构工作原理和应用-108-乳腺癌Caspases早期细胞凋亡AnnexinV/PI流式细胞仪基本结构工作原理和应用-109-移植免疫流式细胞仪基本结构工作原理和应用-110-CD25高于正常值5-10%,表明即将或已发生排斥CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染

<0.2时,必须停用免疫抑制剂CD2+HLA-DR+增加5-10%,且不伴有CD25的增加提示巨细胞病毒感染移植后免疫监测流式细胞仪基本结构工作原理和应用-111-血小板流式细胞仪基本结构工作原理和应用-112-血小板活化静止血小板活化血小板流式细胞仪基本结构工作原理和应用-113-血小板活化流式细胞仪基本结构工作原理和应用-114-网织血小板ITP(特发