TCIRA 56-2023 辐照灭活高致病性病毒剂量的确定方法

中国同位素与辐射行业协会IT/CIRA56—2023前言 Ⅲ1范围 12规范性引用文件 13术语和定义 1 25材料与设备 26指示病毒预试验 27高致病性病毒辐照灭活试验 38病毒灭活有效性与最低有效辐照灭活剂量判定 3附录A(规范性)辐照设备剂量标定方法 4 7Ⅲ1T/CIRA56—2023辐照灭活高致病性病毒剂量的确定方法本文件规定了辐照灭活高致病性病毒剂量的确定方法，包括材料与设备、指示病毒预试验、高致病性病毒辐照灭活试验、病毒灭活有效性与最低有效辐照灭活剂量判定等要求。本文件适用于在BSL3、BSL4实验室中使用电子束辐照灭活高致病性病毒剂量的确定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB18871电离辐射防护与辐射源安全基本标准WS/T367—2012医疗机构消毒技术规范WS/T775—2021新型冠状病毒消毒效果实验室评价标准病原微生物实验室生物安全管理条例中华人民共和国国务院424号令3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。高致病性病毒highlypathogenicvirus能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的病毒。病毒灭活virusinactivation通过物理或化学方法使病毒失去感染性。吸收剂量absorbeddose电离辐射授予质量为dm的物质的平均能量de除以物质质量dm的商。最低有效灭活剂量minimumeffectivedose为达到灭活病毒目的所需要的最低吸收剂量，即工艺剂量下限值。病毒滴度virustiter单位体积液体中具有感染能力病毒的数目。2半数组织培养感染剂量50%tissuecultureinfectivedose能在50%细胞培养板孔引起细胞病变(cytopathiceffect,CPE)的病毒量，是病毒滴度常用的测量在病毒去除和灭活工艺验证研究中使用的用于显示工艺处理效果的感染性活病毒。4原理失去感染性。用细胞感染法测定辐照处理前后样本中病毒灭活效果，以细胞病变作为判断指标；辐照处理使病毒滴度对数值不低于4的样品失去感染性，判断为有效灭活。使病毒滴度值等于4的样品失5材料与设备应满足以下条件：b)单次辐照剂量0～150kGy;c)加速器能放置于BSL3、BSL4实验室内。需满足以下条件：c)辐照设备使用前应进行剂量率标定，具体按照附录A执行。6指示病毒预试验需满足以下条件：a)所选指示病毒应和拟开展试验的高致病性病毒属于同一种属；b)所选指示病毒应属于低致病性或宿主为非灵长类的病毒，可在低安全等级实验室开展相关3对指示病毒采取的辐照灭活试验方法、条件、操作步骤和判定标准等应与拟开展试验的高致病性病毒一致。a)先对高致病性病毒样品进行滴度测定，试验病毒滴度对数值应≥4.0;b)通过调整上样量和稀释，使至少一次试验的样品中待测病毒滴度对数值等于4.0;取病毒载体置于细胞培养板中，并进行密封处理，再放入加速器辐照装置内腔内。根据预实验结果，设置不同辐照剂量梯度，辐照处理至相应的时间取出。辐照后的样品放入用10min,混匀洗脱。7.2灭活组和7.3对照组按照终点稀释法分别进行病毒滴度测定，试验重复3次。具体步骤按照WS/T775—2021中载体制备和载体法灭活试验。8病毒灭活有效性与最低有效辐照灭活剂量判定用细胞感染法测定辐照处理前后样本中病毒的量，以病毒侵染后细胞病变作为判断指标。使用a)阴性对照组细胞生长正常；b)阳性对照组病毒滴度对数值应≥4.0;满足8.2有效性判定标准且病毒滴度对数值等于4.0对应的辐照剂量最小值，即为最低有效辐照灭活剂量。4(规范性)辐照设备剂量标定方法A.1剂量计采用B3薄膜剂量片。A.2.1分光光度计：能提供520nm光波波长；波长精度±2±0.5%(T)(SRM930D);透射比重复性0.3%(T);光谱带宽6nm;杂光≤0.5%(T)(360nm,NaNO₂)。A.2.4镊子：用于夹取剂量片，防止其他拿取方式污染薄膜剂量片。A.3.1将一张A4纸平铺在托盘上(公司提供的标准高度24mm托盘),要求纸张要与金属托盘贴合A.3.2将纸张多余部分去除。标注1个测量点(一侧1个，共3个点)。如图A.15托盘托盘剂量片图A.2剂量片在托盘上的放置位置示意图A.3.5剂量片放置好后需要对其进行固定(设备在辐照时设备会通入氮气，流动的氮气会将轻薄的剂量片吹移位置)。固定方法是在剂量片的边缘采用纸胶带粘接固定。粘接固定需要固定在对角上的两个点，同时需要注意剂量片要平贴在A4纸上。粘接方法如图A.3所示。图A.3剂量片纸胶带粘接方法示意图A.3.6剂量片固定好后边可放入设备进行剂量测量标定。剂量点击启动。A.3.8辐照完成后将剂量片依次贴在纸上放入烘箱(烘箱温度60℃)保温15min,然后采用分光光度仪读取参数δ。分光光度仪使在用前需要预热30min。A.3.9在使用分光光度仪读数前需要对仪器进行校验。首先打开电源开关等待30min预热，预热完成后按下述步骤操作：a)按“MODE”键进入“T”挡；在完成上述操作就即可进行剂量片读数。6T/CIRA56—2023的参数δ做好记录。然后用δ参数的剂量对照表读取3个读取参数δ1、δ2、0₃分别所对应的剂量读数值记为D₁、D₂、D₃。最后根据公式(A.1)计算辐照平均剂量D:通过分光光度仪测量的剂量读数值。7T/CIRA56—2023[1]GB/T25306辐射加工用电子加速器工程通用规范[2]T/CIRA29—2022冷链食品表面的新型冠状病毒灭活剂量要求[3]WS588—2018手足口病诊断perimentPatholuPharmakol.1931;162:480-483[5]孙廷丽，韩玉茹，王青柏，等.噬菌体作为指示病毒的应用研究进展[J].微