TSATA 071-2024 水中总大肠菌群、大肠埃希氏菌和粪大肠菌群的测定荧光检测法

ICS13.060.01Determinationoftotalcoliform,EscherichiacoliandfecalcoliforminwaterIT/SATA071—2024前言 2规范性引用文件 3术语和定义 4方法原理 5试剂与材料 6仪器和设备 27样品 27.1样品的采集 27.2样品的保存 27.3试样的制备 27.4空白试样的制备 28分析步骤 38.1试样测定 38.2空白试验 38.3阳性和阴性对照试验 39结果计算与表示 39.1定量分析 39.2结果表示 310质量保证和质量控制 310.1空白试验 310.2平行样的测定 410.3质控样品的测定 410.4培养基的质量检验 410.5菌株保存 411废物处理 4T/SATA071—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本标准可能涉及某些有危险性的材料、操作和设备，但是并未对与此有关的所有安全问题都提出建议。因此，使用者在应用本标准前应建立适当的安全和防护措施，并确定相关规章限制的适用性。本文件由深圳市分析测试协会提出并归口。本文件起草单位：广东粤海水务检测技术有限公司、广东粤海水务股份有限公司。本文件主要起草人：路晓锋、杨颖、彭俊翔、游文丹、郭瞻宇、王樊、黄俊能、吴凡、黄子其、陆心卉、韦雪柠、陈桂畅、戴欢、吴金鑫、黄慧星、龙庆平、冯国仁、王庆生、何振乾、文金丽、郑开云、杨创涛、彭鹭、李秀虹、陈诚、吴国秋、曾惠、卢鹏澄、潘明茗、甘林林。1T/SATA071—2024水中总大肠菌群、大肠埃希氏菌和粪大肠菌群的测定荧光检测法本文件提供了测定水中总大肠菌群、大肠埃希氏菌和粪大肠菌群的荧光检测法。本文件适用于地表水中总大肠菌群、大肠埃希氏菌和粪大肠菌群的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法HJ91.2-2022地表水环境质量监测技术规范GB/T14581水质湖泊和水库采样技术指导HJ494水质采样技术指导3术语和定义HJ1001-2018界定的术语和定义适用于本文件。3.1总大肠菌群totalcoliforms在37℃培养能产生β-半乳糖苷酶，分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成黄色的邻硝基苯酚的肠杆菌科细菌。[来源：HJ1001-2018，3.1]3.2大肠埃希氏菌escherichiacoli俗称大肠杆菌，在37℃培养能产生β-半乳糖苷酶，分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成黄色的邻硝基苯酚，同时产生β-葡萄糖醛酸酶，分解选择性培养基中的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷释放出荧光物质的肠杆菌科细菌。[来源：HJ1001-2018，3.3]3.3粪大肠菌群fecalcoliforms又称耐热大肠菌群（thermotolerantcoliforms）。在44.5℃培养能产生β-半乳糖苷酶，分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成黄色的邻硝基苯酚的肠杆菌科细菌。[来源：HJ1001-2018，3.2]4方法原理使用试剂盒进行总大肠菌群、大肠埃希氏菌和粪大肠菌群的检测，利用试剂盒中酶底物培养基，一定量的水样与培养基混合均匀放置于适宜温度下（总大肠菌群和大肠埃希氏菌37℃±1℃、粪大肠菌群44.5℃±0.5℃)环境下，当细菌生长时，可利用乳糖发酵产酸产气，产生特定的酶，并水解不同的底物生成荧光物质,依据待测水样荧光强度变化与水中的总大肠菌群、大肠埃希氏菌和粪大肠菌群数成一定关系的原理，从而得出总大肠菌群、大肠埃希氏菌和粪大肠菌群浓度。5试剂与材料2T/SATA071—2024除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为符合GB/T6682标准的一级5.1硫代硫酸钠（Na2S2O3▪5H2O）。5.2乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na2▪2H2O）。5.3硫代硫酸钠溶液：ρ（Na2S2O3）=0.10g/mL。称取15.7g硫代硫酸钠（5.1），溶于适量水中，定容至100mL，临用现配。5.4乙二胺四乙酸二钠溶液：ρ（C10H14N2O8Na2▪2H2O）=0.15g/mL。称取15.0g乙二胺四乙酸二钠（5.2溶于适量水中，定容至100mL，此溶液保质期为30d。5.5无菌水：取适量实验用水，经121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。5.6试剂盒：包括用于检测粪大肠菌群的试剂盒和用于检测总大肠菌群、大肠埃希氏菌的试剂盒。6仪器和设备6.1全自动微生物检测系统。6.2采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的100mL、250mL、500mL广口玻璃瓶。6.3高压蒸汽灭菌器：121℃可调。6.4量筒：100mL±1mL。6.5移液管：1mL±0.01mL、10mL±0.1mL。也可采用计量合格的可调式移液器。6.6三角瓶：100mL。6.7天平：感量0.01g。注1：在采集不存在或不考虑余氯、金属离子干扰的样品时，可采用市售7样品7.1样品的采集采集河流、湖库等地表水样品时，可握住瓶子下部直接将带塞的采样瓶插入水中，约距水面10cm-15cm处，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平往前推。采样量一般为采样瓶容量的80%左右。样品采集完毕后，迅速扎上无菌包装纸。也可使用灭菌过的专用采样装置采样。在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行，以免不同层次的搅扰。如果采集的是含有活性氯的样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（5.3），以除去活性氯对细菌的抑制作用（每125mL容积加入0.1mL的硫代硫酸钠溶液）；如果采集的是重金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液（5.4以消除干扰（每125mL容积加入0.3mL的乙二胺四乙酸二钠溶液）。注：15.7mg硫代硫酸钠（5.3）可去除样品中1.5mg活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。7.2样品的保存采样后应在2h内检测，否则，应10℃以下冷藏但不得超过6h。实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品于4℃以下冷藏并在2h内检测。7.3试样的制备对于较为洁净的地表水，可直接取地表水样品100mL进行检测，如需对样品进行稀释，可采用10倍逐级稀释法对样品进行稀释。7.4空白试样的制备以灭菌水代替样品，直接取100mL水样进行检测。3T/SATA071—20248分析步骤8.1试样测定根据样品污染程度确定接种量。通常接种量为100mL。当接种量小于100mL时，应稀释样品后接种，接种量为10mL时，取10mL样品加入到盛有90mL无菌水（5.5）的三角瓶（6.6）中混匀制成1:10的稀释样品，其它接种量的稀释样品依次类推。将接种后的检测套筒放置于全自动微生物检测系统内，粪大肠菌群设置FCA检测模式，培养温度为44.5℃,在2h～18h后仪器自动培养得出结果；总大肠菌群和大肠埃希氏菌设置CCA检测模式，培养温度为37℃,在2h～18h后仪器自动培养得出结果。8.2空白试验按照与试样测定（8.1）相同的操作步骤进行空白试样（8.2）的测定。8.3阳性和阴性对照试验将标准菌株制成300～3000个/mL的菌悬液，按照试验测定（8.1）过程操作，阳性菌株应呈阳性反应，阴性菌株应呈阴性反应。否则，该次样品测定结果无效。也可使用市售的已知浓度的定量菌株进行操作。总大肠菌群、大肠埃希氏菌和粪大肠菌群的阳性、阴性菌株参考表1。表1阳性、阴性菌株参考表大肠埃希氏菌、产气肠杆菌（Enterobacter假单胞菌属(Pseudomonassp.)大肠埃希氏菌（耐热型）、克雷伯氏菌属9结果计算与表示9.1定量分析样品中总大肠菌群、大肠埃希氏菌和粪大肠菌群的浓度C按照公式（1）进行计算。式中：C——样品中总大肠菌群、大肠埃希氏菌和粪大肠菌群浓度，MPN/L；MPN——仪器的读数值，即每100mL样品中总大肠菌群、大肠埃希氏菌和粪大肠菌群浓度，MPN/100mL；1000——将C单位由MPN/mL转换为MPN/L；f——最大接种量,mL。9.2结果表示测定结果保留两位有效数字，当测定结果≥100MPN/L时，以科学计数法表示，若结果为阴性时，可报告为＜10MPN/L或未检出。10质量保证和质量控制10.1空白试验4T/SATA071—2024每批