DB34∕T 4203-2022 猪肠外致病性大肠杆菌分离鉴定规程

34RegulationfordetectionofextraintestinalpathogenicEscherichiacolifromswineI本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定1猪肠外致病性大肠杆菌分离鉴定规程GB4789.6食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏GB4789.38食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏GB4789.41食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌SN/T2025动物检疫实验室生SN/T2984检验检疫动物病原微生物实验活动生物3.1肠外致病性大肠杆菌extraintestinalpatho4主要设备和材料4,1显微镜：10×~100×。4,4冰箱：0℃~4℃。4,6无菌试管：12mm×100mm，15mm×150mm。4.7麦氏比浊管。2）：5操作规程5.2操作步骤5.2.1样品采集采集：无菌操作采集病猪的肝脏、肺脏、脾脏、淋巴结、脑等肠外组织，或关节积液、心包保存与运输：病料样品采集后不能及时盐水溶液中，保存时间不超过72h。样品均需采取低温（0℃~4℃)保存和运输。5.2.2细菌分离与纯化落呈鲜桃红色或粉红色，中等大小，直径1.0mm～2.5mm，圆形，边缘整齐，表面光滑）再5.2.3肠外大肠杆菌鉴定形态特征鉴定：革兰氏染色镜检。大肠杆菌为革兰氏阴性直短杆菌，两端钝圆，无芽孢，多生化特性鉴定：先取纯化菌落接种三糖铁（TSI）琼脂斜面糖蛋白胨水、枸橼酸盐培养基，37℃培养18h～24h，进行吲5.2.4肠外大肠杆菌致病性鉴定并将死亡的小鼠在无菌操作下取其肺脏、肝脏、脾脏组织分别接种于MAC，37℃培养24h，挑取大肠35.2.6肠外致病性大肠杆菌系统进化群鉴定4A.1饱和氯化钠溶液A.1.1成分A.1.2制法将38.0g～39.0g氯化钠加入100mL蒸馏水中，充分搅拌，待完全溶解混匀后，分装于采样A.230％甘油缓冲盐水溶液A.2.1成分A.2.2制法A.3.1成分A.3.2制法5↓（菌落呈鲜红色或粉红色，中等大小，直径1.0mm～2.5m↓↓（TSI：斜面和底面均变黄或变红，产气，不产H2S。↓↓↓6取O抗原分别与大肠杆菌的O抗原单因子血清进行玻片凝集反应。即O抗原和O抗原单因子血清各取混合物作对照，观察有无自凝集现象。玻片凝集试验判定标+-a)O抗原单因子定型血清的稀释：采取倍0.5mL加入第1管，在管内反复吹打6～8清稀释倍数分别是1:20，1:40，1:80b)加入抗原：向各支试管中分别加入0.5mLO抗原，此时血清稀释倍数相应增大一倍；3)凝集强弱判断（以“＋”表示确定抗体凝集效价时，应以出现“++ℽ（50凝集现象•“++++ℽ液体完全透明，100％凝集，管底出现大片的•“+++ℽ液体几乎透明，75％凝集，管底有明显的伞状沉淀，震荡时呈小或大絮片状；7•“++ℽ液体中等混浊，50％凝集，管底有中等量的伞状沉淀，震荡时呈小絮片状；•“+ℽ液体透明度不明显，25％凝集，管底有少许不明显的伞状沉淀；•“-ℽ抗原抗体不凝集，液体混浊、无透明度，管底无伞状沉淀，但由于菌体自然下沉，管82×PCRMasterMix、超纯水、琼脂糖、10mg/ML溴化乙锭（EB）、TBE缓（10×LoadingBuffer）、相对分子质量Mar猪肠外致病性大肠杆菌系统进化群PCR鉴定用引物yjaAyjaA-FyjaA-RTspE4.C2-FD.2.2ExPEC的系统进化群分9V，电流10