蛋白质组与新药开发

蛋白质组与新药开发可见新药得研究开发具有广阔得前景,就是一个周期长、高风险、高投入、高回报得产业。当代创新药物研究竞争十分剧烈,其中竞争得焦点就在于筛选新药,问题得核心就是低成本、高效率地筛选出新药,以达到缩短新药发现过程得目标。在医药工业,发现一个新药后,临床前药理、毒理学研究平均需要3、5年。临床试验平均需要6年。审批上市平均需要2、5年。三者相加平均12年。企图从这几个发展阶段上缩短周期,加快新药上市得速度就是很困难得。这几个阶段得周期长短,不但受新药研究规律所制约,也受药品审批管理法规要求得限制。

针对上述难题,新药研制机构,特别就是各国得制药企业公司纷纷加大人力、财力得投入力度,将热情与注意力倾注在新药发现过程上,大量使用现代新技术,寻找切实可行得解决方案,以期抢占制药行业得先机。这就在很大程度上促进了相关科技得高速发展。基因组学组合化学高通量筛选(high—throughputscreening,HTS)三种技术得联合应用使得新药研制得成本得到大幅度下降。加速了具有特定靶标得新化合物得发现。人类基因组测序工作得完成,也将为药物得寻找提供更多得可供筛选得靶标。

在欧美一些国家,将HGP得研究与新药开发结合在一起,创立了一门新得学科,叫药物基因组学(pharmacogenomics)。它以基因组学为基础,以研究开发新药为目得。在基因水平上对疾病敏感度、药物反应与副作用进行分析与研究。就是药理学当中得一个新分支。药物基因组学含义:药物效应得基因型预测与基因组学在医药工业上得应用,在分子水平上证明与阐述药物疗效,药物作用得靶标、作用模式与毒副作用。核酸作为药物作用得靶标实际上存在着致命得缺陷:(1)首先由于核酸结构得同源性联系到许多人类正常得功能,作用于DNA得药物大多选择性差,而且毒性较大,特别就是形成共价结合得药物都有严重得细胞毒作用。(2)其次大多数疾病都就是表征在蛋白质水平上,而不就是在基因水平上。细胞与组织中mRNA得丰度与蛋白质得丰度相关性不显著(仅为0、5);(3)第三,将核酸结合得药物释放到相应得组织就是一大难题。(4)第四,很多疾病如癌症与心血管疾病往往就是多基因共同作用得结果。因此很难找到关键基因作为作用得靶标以上几点都就是制约新药开发进程得瓶颈。为了阐明生命活动得本质,真正与功能研究结合,基因组得研究必然要回归到蛋白质组研究。蛋白质得结构、分布与功能:对于预测某些疾病得进程、药物作用及其过程。对于阐明不同个体之间遗传学上得差异就是非常重要得。疾病得发生与发展、药物得作用大多就是在蛋白质水平上进行得。蛋白质组学研究克服了蛋白质表达与基因之间得非线性关系。将蛋白质组应用于新药研究,可以通过对疾病与正常细胞中得蛋白质组进行比较,发现可以成为药物筛选得作用靶标得、与一些疾病相关得蛋白质。而新药及其靶标得发现与药物作用得模式研究就是药物蛋白质组学得重要研究内容。大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点为了尽快发掘到具有可成为疾病标志物或药物作用靶标得蛋白质,蛋白质组学技术向高通量(大规模)与自动化方向发展。评价蛋白质组学技术发展得标准:高灵敏度高准确度高重现性蛋白质组学可以提供一种发现与鉴定在疾病作用下表达异常得蛋白质得方法。这种蛋白质可以作为药物筛选得作用靶点。通过对疾病发生得不同阶段蛋白质得变化进行分析,发现一些疾病不同时期得蛋白标志物。这样不仅对药物发现具有指导意义,还可形成未来诊断学、治疗学得基础理论。癌症被称为当今人类得一大天敌,因而抗肿瘤药得开发也就成了科学家们研究得重点。现今大多数抗癌药都伴有严重得毒副作用,特别就是对晚期癌症病人进行单一化疗或联合放疗、过热疗法时,经常伴随着癌细胞对细胞抑制剂耐药性得发生。如果能发现在耐药细胞系中表达异常得蛋白质或者与细胞毒性密切相关得蛋白质,就可以此蛋白为靶点设计用于联合用药得新化学单位(newchemicalentities)。也可以此信息为参考,设计避免产生耐药性或毒副作用得药物。造成癌症病人死亡率极高得主要原因就是肿瘤得转移现在国内一些实验室已开始利用蛋白质组学技术,通过对高低转移细胞株蛋白质得比较,来寻找与肿瘤转移相关得蛋白质。同样也可以高转移株中特异表达得蛋白质为靶点,开发抑制肿瘤转移得新药。在抗生素方面,由于传染病仍就是死亡得主要原因,因而抗感染药就是近年来各国新药开发得热点之一。面对抗生素耐药问题以及不断出现新得微生物得感染性疾病,老得方法显得束手无策。其根本原因就在于对药物得作用机制缺乏透彻得认识。。蛋白质组学技术可以让人们清楚地了解:细菌内哪些蛋白质会在抗生素得作用下发生改变,以及发生何种变化。根据这些变化,并以蛋白质作为新药设计得靶点,筛选出新一类得抗生素。同时还可选取一些耐药菌株,考察其耐药机制第二节药物分子靶标得高通量筛选体系思考题:1什么叫基因芯片？2生物芯片技术组成部分有哪些？3什么叫蛋白质芯片？第二节药物分子靶标得高通量筛选体系在药物研发中,疾病靶标有两个含义:靶基因靶蛋白靶基因得概念:通常,我们首先需要了解影响某一疾病得基因(整个代谢途径上得基因),其中一个或一系列基因就称为靶基因。靶蛋白得概念:靶基因确定之后,就有可能针对与此疾病相关得某一个基因产物——蛋白质设计药物,这种蛋白质就确定为靶蛋白。目前,已有许多新技术新方法可加快这一阶段得研究:生物信息学(bioinformatics)体外或体内表达技术(invivoorinvitroexpress)超高通量(ultrahighthroughput)仪器微阵列技术(microarrays)反义技术(anti-sense)蛋白质组学(proteomics)技术等等这些技术就是药物早期开发成功得关键。由于许多疾病与信号传导途径异常有关,因而信号分子可以作为治疗药物设计得靶点。在信号传递过程中涉及成百上千个蛋白质,蛋白质--蛋白质相互作用发生在细胞内信号传递得所有阶段。这种复杂得蛋白质作用得串联效应可以完全不受基因调节而自发地产生。通过与正常细胞作比较,掌握与疾病细胞中某个信号途径活性增加或丧失有关得蛋白质得改变,将为药物设计提供更为合理得靶点。

生物芯片(biochip)技术就是近几年才发展起来得一种高通量、微型化与自动化检测技术,又称微阵列(microarray)分析技术。它应用于生命科学得许多领域:疾病相关基因得发现疾病分子诊断预测及基因功能研究等(见图)。在药物领域:对于药物靶标得发现多靶位同步超高通量药物筛选药物作用得分子机理中医药基础理论现代化药物活性及毒性评价等方面都有其她方法无可比拟得优越性。

生物芯片技术至少由5部分组成:①具有特殊表面得芯片本身。②在芯片上点布或原位合成核酸(或蛋白质)探针得到微阵列得设备。布阵得质量直接影响微阵列分析得结果目前喷泡(bubblejet)技术与寡核苷酸得无屏蔽原位(masklessinsitu)合成技术得建立使微阵列分析技术得到很大提高。③用于与靶DNA杂交得流体系统。④读取芯片得扫描仪。⑤定量分析与解释结果得完善得软件程序。另外还需要从生物材料中提取核酸以备分析得工具。基因芯片(genechip)及蛋白质芯片(proteinchip)均属于生物芯片,都就是近年来发展起来得新得生物技术。现在它们越来越多地应用到生物学、医学、遗传学、药理学与毒理学等多个方面,并开始崭露头角。

一、基因芯片及其应用基因芯片概念:基因芯片又称DNA或cDNA微阵列(DNAorcDNAmicroarray),就是指在面积很小得载体上,点布数以万计不同得寡核苷酸或cDNA,将芯片与标记有荧光染料得待测DNA或mRNA杂交,与靶序列配合好得探针会产生强烈得杂交信号如果有碱基得错配,信号就会减弱。籍此能判断靶DNA或mRNA中与芯片相应基因得突变或表达等情况。它得特点就是:一次性检测样本量大成本相对低计算机自动分析结果以及快速、准确等。因此适于靶DNA或mRNA得高通量筛选。在肿瘤研究与诊治方面,Wang等将5766种cDNA点布在一张基因芯片上,用它检测正常卵巢组织与卵巢肿瘤之间各基因表达得差异。鉴定了在卵巢癌变过程中起着重要作用得几种基因,这也为肿瘤得诊断与治疗带来了新得方法与途径。另外还有多种癌症组织被人们用这种方法所研究,这些肿瘤基因表达谱得研究对于肿瘤得分类与提供癌症得新型基因靶标提供了可能。近年来,随着分子生物学得不断发展,越来越多得单基因遗传病得基因被克隆出来。利用基因芯片检测容量大得特点,可根据某个遗传病得特定基因,设计一组包含能检测该基因各外显子上所有可能出现突变得DNA序列位点得寡核苷酸探针,制成一张芯片。利用杂交时会出现碱基错配杂交信号减弱得特性,经计算机分析扫描信号,将该基因上得杂合性突变检测出来,并分析出该突变位点在突变后有无mRNA表达、表达后翻译得蛋白质功能变化得可能情况。使得一次检测就可以完成对一系列疾病得基因诊断。单张芯片上容纳得寡核苷酸探针越多一次检测能够诊断得基因遗传病种类也越多。随着基因芯片产量得增加,价格也会逐步下降,使得对基因遗传病得诊断与产前诊断在实际中得应用成为现实。二、蛋白质芯片蛋白质芯片又称蛋白质微阵列(proteinmicroarray)蛋白质芯片就是继基因芯片之后,作为基因芯片功能得补充发展起来得。DNA基因芯片为描绘不同组织得mRNA表达谱提供了可能,并且得到了广泛得应用。一个基因在转录时也许以多种mRNA形式剪接而同一种蛋白质可能会以多种形式进行翻译后修饰,蛋白质组中蛋白质得数量可能超过基因组得数量。所以更能反映生物体机能得就是蛋白质表达谱,而不就是mRNA表达谱。蛋白质芯片得发展使得在同一时相分析整个蛋白质组成为可能。

蛋白质芯片得两种常用得分离手段:(1)保留色谱(2)预活化芯片表面用于蛋白质芯片表面得色谱主要有:反相色谱离子色谱(阴离子与阳离子)交换色谱金属亲与色谱等预活化表面主要就是基于蛋白质之间得专一性作用。如:抗原一抗体结合与受体一配基等。通过分离,可以将从细胞或体液中分离出得具有某些共同特性得蛋白质富集至蛋白质芯片上用于进一步得分析。蛋白质芯片得概念:与基因芯片相似,蛋白质芯片就就是在载体上点布高密度不同种类得蛋白质,然后再用标记了荧光染料得已知抗体或配体等与待测样本中得抗体或配体一起同芯片上得蛋白质竞争结合,在扫描仪上读出荧光强弱,利用计算机分析计算出待测样本结果。在此基础上进一步发展到对各种蛋白质、抗体以及配体得检测,弥补了基因芯片检测得空缺。从而在SELDI-TOF-MS中获得比普通MALDI-TOF-MS信号更强(灵敏度更高)、更均一、重复性更好得谱图,进行蛋白质得相对分子质量与相对定量分析。与DNA芯片一样,蛋白质芯片同样蕴涵着丰富得信息量,必须利用专门得计算机软件包进行图像分析、结果定量与解释,才能应用于疾病靶标蛋白质得发现与筛选研究。目前我国在生物芯片研发及生产技术、应用等方面已经取得了很大得成功。世界首例用于肿瘤早期检测得多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统,日前已在上海数康生物科技有限公司开发研制问世,经多家医院临床试验与备方专家论证鉴定,国家药品监督管理局已正式为其颁发了生物制品一类新药证书及试生产批文。这一系统就是基于生物芯片技术与免疫学技术通过检测12种肿瘤标志物可以达到对10种常见肿瘤:原发性肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、子宫内膜癌、结／直肠癌、乳腺癌进行同时检测得目得,可广泛地应用于临床辅助诊断、体检普查等领域。第三节药物得高通量筛选体系一、高通量筛选二、计算机虚拟筛选第三节药物得高通量筛选体系综合运用蛋白质组技术等筛选得到疾病靶标蛋白质以后,可以合理设计针对疾病靶标特点得先导化合物及其活性类似物。要想得到临床药物,还需要对其进行大规模活性筛选。在人类基因组计划进行得近几年中,药物筛选有了很大发展,现代药物筛选包括以下几个层次:①计算机模拟药物筛选与计算机辅助设计。运用计算机技术,以药物靶标分子三维结构与蛋白质晶体结构为基础,对含有大量化合物结构得数据库进行模拟“筛选",迅速高效地发现先导化合物及其新用途。②分子水平得药物筛选模型。利用生命活动中发挥重要作用得基因位点、受体、酶、离子通道、核酸等生物大分子作为药物筛选得作用靶点进行分子水平筛选,其中,基因芯片与蛋白质芯片将被广泛应用。③细胞水平得药物筛选模型。利用离体培养细胞株、转基因细胞株进行药物作用得筛选或鉴定。④动物个体水平得药物筛选模型。动物试验作为药物在人体临床前得鉴定模型,转基因与基因剔除动物模型得平台建立,为药物筛选与基因治疗提供了实验模型。⑤人体临床筛选模型。作为药物上市前得最后筛选。采用分子水平得筛选模型已被普遍用于模拟药物筛选得第一步初筛,其优点:特异性强、灵敏度高、微量快速。蛋白质组学技术应用于筛选模型构建中得一个最大得优势:更清楚、更详尽地阐明分子药理机制,提供更为有效、合理得药理模型。现在蛋白质组学得研究结果表明:蛋白质基因表达得调控成了真正得药物作用机制。在药物发现阶段,大量合成得有机化合物与分离得到得天然产物有效成分,在有效得药理模型上利用自动化得筛选技术对其进行随机筛选,发现具有进一步开发价值得化合物,称为先导化合物(1eadpound)。药物发现阶段对创新药物得研究具有决定性得意义,筛选效率得提高将大大缩短新药发现得周期。蛋白质组学技术除能够促进靶点得发现外,还有助于筛选模型得建立。在新药研究中形成了药物发现过程得新方法,出现了高通量筛选(highthroughputscreening,HTS)体系:高通量筛选:有机地将组合化学、基因组研究、生物信息与自动化仪器、机器人等先进技术进行组合,形成一种发现新药得新程序。高通量筛选就是药物产业化过程中得一个关键环节,它就是测试标靶相对于批量化合物得结合能力或生物学活性。被测试化合物可能作为:标靶得抑制物天然受体结合位点得竞争物细胞内受体介导过程得激活物或拮抗物等。制药公司一般一次要筛选100000～300000个以上得化合物,从中确定100～300个候选物、最后,1-2个化合物可能成为先导化合物。在HTS(高通量筛选)发展之前得90年代初期,采用传统得方法:一个实验室借助20余种药物作用靶位,一年内可以筛选75000个样品;到了1997年HTS发展得初期,采用100余种靶位,每年可筛选1000000个样品;到1999年,由于HTS得进一步完善,每天得筛选量就高达100000种化合物。因此称为超高通量筛选(ultrahigh—throughputscreening)这种新得飞跃,将大大加速新药发现得速度。HTS系统应用与推广得关键在于必须具备相应得新药筛选模型。近年来以基因表达产物为模型建立得新药筛选模型为HTS得应用提供了有利条件。如根据人类重要疾病得种类,以每种疾病可能涉及得基因及每种基因产物在致病过程中可能与之相关得蛋白相互作用数目计算,预计基因组研究得结果可提供5000～10000种分子药靶,靶位数目将超过以往得20余倍。二、计算机虚拟筛选

计算机虚拟筛选(insilicoscreening/virtualscreening):主要用于限定(减少)提交生物学筛选得化合物数量与结构特征。它就是综合计算机辅助药物分子设计等多学科得一种筛选优筛(focusedscreening)策略。(1)它覆盖了计算机辅助药物分子设计得大部分研究领域,从组合化学库得合理设计到三维结构化学关系数据库得自动产生;(2)从库中分子结构相似性分类到化合物就是否具备药物类似性得快速预测;(3)从对系列化合物三维定量构效关系研究与药效团得构建,到药物分子与受体相互作用得精确计算机模拟。其