《细胞生物学实验》笔记

《细胞生物学实验》笔记（1-15章）第一章：细胞生物学概论1.1细胞的概念及其重要性细胞是所有生命体的基本单位，它们通过复杂的内部结构和功能来维持生命活动。1.1.1生命的多样性原核生物：单细胞生物，如细菌，没有真正的细胞核。真核生物：包括植物、动物和真菌等，具有复杂的细胞结构，如细胞核和其他细胞器。1.1.2细胞的共同特征细胞膜：由脂双层构成，控制物质进出。DNA：存储遗传信息的分子。蛋白质合成：发生在核糖体上，由mRNA指导。1.2细胞生物学的历史发展细胞生物学的发展是一个逐步深入的过程，从最初的细胞发现到今天复杂的分子机制研究。1.2.1早期观察罗伯特·胡克于1665年首次描述了细胞壁。列文虎克改进了显微镜，观察到了活细胞。18世纪至19世纪的发展细胞学说：1838年由施莱登和施旺提出，确立了细胞作为构成生物的基本单元的地位。细胞分裂：1879年，瓦尔德耶尔发现了有丝分裂。20世纪至今分子生物学：随着DNA双螺旋结构的发现，人们开始从分子水平研究细胞。基因组学：通过对基因组的研究，揭示了细胞功能背后的遗传密码。1.3实验研究中的基本伦理原则在细胞生物学研究中，伦理原则至关重要，确保研究合法且尊重生命。1.3.1动物实验伦理3R原则：减少（Reduction）、替代（Replacement）和精炼（Refinement）。伦理审查委员会：监督实验设计，确保最小化痛苦。1.3.2人类细胞样本使用知情同意：获取样本前需获得捐赠者的明确同意。数据匿名化：保护个人隐私，防止信息泄露。第二章：细胞结构与功能2.1细胞膜的组成与功能细胞膜不仅是细胞的边界，还参与多种生命活动。2.1.1脂质双层结构磷脂分子：头部亲水，尾部疏水，排列形成屏障。胆固醇：增加膜的流动性。2.1.2蛋白质嵌入跨膜蛋白：负责运输物质进出细胞。连接蛋白：帮助细胞之间建立联系。2.2细胞器的功能与定位细胞内的各个部分分工明确，共同维持细胞的生命活动。2.2.1核糖体功能：负责蛋白质的合成。位置：游离在细胞质中或附着于内质网上。2.2.2内质网粗面内质网：表面附有核糖体，参与蛋白质加工。滑面内质网：无核糖体，参与脂质合成和解毒。2.2.3高尔基体功能：包装、修饰蛋白质，准备分泌。位置：靠近细胞核，便于接收来自内质网的物质。2.2.4溶酶体功能：含有多种酶，参与废物分解。位置：广泛分布于细胞质中。2.3核酸与蛋白质合成过程核酸是遗传信息的载体，而蛋白质则是实现这些信息的关键分子。2.3.1DNA复制半保留复制：新合成的DNA分子由一条旧链和一条新链组成。酶的作用：DNA聚合酶负责合成新的DNA链。2.3.2转录RNA聚合酶：合成mRNA，携带DNA的信息到细胞质。启动子：识别并结合RNA聚合酶的位置。2.3.3翻译核糖体：读取mRNA上的密码子，合成相应的蛋白质。tRNA：携带氨基酸到核糖体，与mRNA配对。第三章：显微镜技术3.1光学显微镜的使用原理光学显微镜是最常用的细胞观察工具，适用于观察活细胞和固定样本。3.1.1透射光显微镜原理：光线穿过样本，通过透镜放大成像。用途：观察细胞内部结构。3.1.2暗视野显微镜原理：通过特殊照明方式增强对比度。用途：观察透明或半透明的活细胞。3.2电子显微镜的工作机制电子显微镜可以提供更高的分辨率，适用于观察细胞表面和超微结构。3.2.1扫描电镜原理：用细束电子扫描样品表面，收集反射电子成像。用途：观察细胞表面形态。3.2.2透射电镜原理：电子穿透薄切片样本，在荧光屏上成像。用途：观察细胞内部超微结构。3.3显微成像技术的应用显微成像技术不断发展，为细胞生物学研究提供了更多可能。3.3.1荧光显微镜原理：特定波长的光激发荧光染料发光。用途：标记特定分子或细胞结构。3.3.2激光共聚焦显微镜原理：使用激光点扫描，消除非焦平面的干扰。用途：三维重构细胞结构，高分辨率成像。第四章：细胞培养基础4.1细胞培养的必要条件细胞培养是在实验室条件下模拟体内环境，以维持细胞生存的技术。4.1.1温度标准温度：通常为37°C，模拟人体内环境。4.1.2气体环境CO₂浓度：保持在**5%**左右，以维持培养基的pH值稳定。氧气：维持正常的细胞代谢。4.1.3营养供应氨基酸：提供细胞生长所需的原料。维生素和矿物质：支持细胞代谢。4.1.4pH值稳定范围：一般在7.2-7.4之间。调整方法：通过添加碳酸氢钠或HEPES缓冲液。4.1.5无菌条件无菌操作：避免微生物污染。抗生素使用：预防细菌感染。4.2培养基的选择与配制培养基是细胞生存的基础，根据细胞类型选择合适的培养基至关重要。4.2.1常用培养基DMEM：广泛应用于哺乳动物细胞。RPMI1640：适合悬浮细胞培养。4.2.2血清补充胎牛血清（FBS）：提供生长因子和其他必需成分。浓度选择：一般为10%。4.2.3无血清培养基优点：减少批次间差异，适合大规模生产。缺点：成本较高，某些细胞不易生长。4.2.4定制培养基适应性：针对特定细胞系优化配方。添加剂：如激素、生长因子等。4.3污染控制及细胞传代技巧细胞培养过程中需要严格控制污染，并掌握正确的细胞传代技术。4.3.1污染类型细菌污染：可通过显微镜观察。霉菌污染：培养基表面出现白色或绿色斑点。支原体污染：细胞生长缓慢，形态改变。4.3.2污染检测显微镜检查：定期观察细胞状态。PCR检测：鉴定支原体污染。4.3.3细胞传代酶消化法：常用胰蛋白酶分离贴壁细胞。非酶法：使用EDTA等化学试剂。4.3.4传代频率细胞密度：达到**80%-90%**汇合时传代。传代比例：根据细胞生长速度调整。第五章：细胞增殖与分裂5.1细胞周期的调控机制细胞周期是细胞生长、分裂和分化的一系列有序过程。5.1.1G1期细胞生长：细胞体积增大，合成RNA和蛋白质。检查点：评估是否进入S期。5.1.2S期DNA复制：DNA含量加倍，准备分裂。修复机制：修复损伤的DNA。5.1.3G2期准备分裂：合成微管蛋白等分裂所需物质。纺锤体组装：为有丝分裂做准备。5.1.4M期前期：核仁消失，染色体凝聚。中期：染色体排列在赤道板上。后期：姐妹染色单体分离。末期：形成两个子细胞。5.2有丝分裂与减数分裂的过程有丝分裂保证了子代细胞与母细胞遗传信息一致，而减数分裂则产生生殖细胞。5.2.1有丝分裂染色体数目不变：保持遗传稳定性。同源染色体分离：姐妹染色单体分别移向两极。5.2.2减数分裂染色体数目减半：形成单倍体配子。交叉互换：增加遗传多样性。5.2.3染色体行为差异第一次减数分裂：同源染色体分开。第二次减数分裂：类似有丝分裂，分离姐妹染色单体。5.3细胞周期同步化技术为了研究细胞周期的调控机制，需要将细胞同步到特定时期。5.3.1机械方法离心法：通过离心力将不同阶段的细胞分离。过滤法：利用细胞大小差异筛选。5.3.2化学方法药物处理：如爱诺沙星抑制DNA合成。饥饿法：限制营养供应使细胞停滞在G1期。5.3.3生物方法温度敏感突变株：在特定温度下停止在某一时期。基因工程：利用CRISPR-Cas9系统调控关键基因。第六章：基因表达调控6.1转录因子的作用机制转录因子通过与DNA特定序列结合来调节基因表达。6.1.1结构域DNA结合域：识别并结合特定的DNA序列。转录激活域：招募RNA聚合酶等辅助因子。6.1.2转录复合物启动子：RNA聚合酶识别的DNA区域。增强子/抑制子：远距离调控基因表达。6.1.3转录因子的种类通用转录因子：参与所有基因的转录。特异转录因子：响应特定信号，调控特定基因。6.2RNA加工与翻译调控mRNA在离开细胞核之前需要经过一系列加工步骤，才能成为有效的翻译模板。6.2.1加帽与加尾加帽：在mRNA的5'端添加7-甲基鸟苷，保护mRNA免受降解。加尾：在3'端添加poly(A)尾巴，提高mRNA稳定性。6.2.2剪接外显子：编码蛋白质的部分。内含子：非编码部分，剪接过程中被去除。6.2.3mRNA转运出核：成熟mRNA从细胞核运往细胞质。翻译：在核糖体上进行蛋白质合成。6.3基因沉默技术（如RNAi）RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是一种重要的后转录基因沉默机制。6.3.1siRNA的合成dsRNA：双链RNA，由两条互补的RNA链组成。Dicer酶：切割dsRNA形成siRNA。6.3.2RISC复合物装配：siRNA与RISC（RNA诱导的沉默复合物）结合。靶向降解：引导RISC识别并切割靶mRNA。6.3.3应用基因功能研究：敲除目标基因，观察表型变化。治疗疾病：设计针对病原体或致病基因的siRNA。第七章：细胞信号传导7.1细胞信号转导通路分析细胞信号转导是指外界刺激通过特定的分子途径影响细胞内活动的过程。7.1.1信号分子激素：如胰岛素、肾上腺素。神经递质：如乙酰胆碱、多巴胺。细胞因子：如生长因子、趋化因子。7.1.2受体细胞表面受体：G蛋白偶联受体、离子通道受体、酶联受体。细胞内受体：位于细胞质或核内，如类固醇受体。7.2G蛋白偶联受体信号途径G蛋白偶联受体（GPCRs）是最常见的细胞表面受体之一。7.2.1G蛋白的激活配体结合：引起受体构象变化。G蛋白结合：α亚基与GTP结合，激活下游效应器。7.2.2效应器激活腺苷酸环化酶：催化ATP转化为cAMP。磷脂酶C：催化PIP₂分解为IP₃和DG。7.2.3下游信号cAMP依赖的PKA：催化蛋白质磷酸化。钙调蛋白：与Ca²⁺结合，激活钙调蛋白依赖的激酶。7.2.4负反馈调节磷酸酶：去磷酸化靶蛋白，终止信号。脱敏：受体磷酸化后与β-抑制蛋白结合，不再激活G蛋白。7.3酶联免疫吸附测定(ELISA)用于信号分子检测ELISA是一种用于检测信号分子如激素、细胞因子等的定量方法。7.3.1直接ELISA包被抗原：将待测抗原固定在微孔板上。抗体标记：加入标记有酶的抗体，与抗原结合。7.3.2间接ELISA包被抗体：使用已知抗体捕获待测抗原。二次抗体：加入标记有酶的抗抗体，识别捕获的抗原。7.3.3竞争ELISA竞争结合：待测抗原与标记抗原竞争有限的抗体位点。检测信号：未结合的标记抗原在洗涤后被检测。第八章：细胞凋亡与自噬8.1细胞凋亡的生化标志物细胞凋亡是程序性细胞死亡的一种形式，对于维持组织稳态至关重要。8.1.1DNA片段化核小体：DNA断裂成约180-200bp的小片段。TUNEL检测：通过末端标记断裂的DNA末端。8.1.2Caspase级联反应启动Caspase：如Caspase-8和Caspase-9。执行Caspase：如Caspase-3和Caspase-7。8.1.3外泌体释放凋亡小体：包含细胞膜碎片和细胞内容物。清除：由邻近细胞或巨噬细胞吞噬。8.2自噬的生理意义与病理作用自噬是一种细胞自我消化的过程，对细胞健康和疾病都有重要影响。8.2.1基本自噬隔离膜形成：围绕待降解物质形成自噬体。融合：自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体。8.2.2选择性自噬靶向选择：通过特定受体识别并标记待降解蛋白。货物输送：通过自噬体运送到溶酶体。8.2.3自噬调节mTOR信号通路：抑制自噬。AMPK信号通路：促进自噬。8.3测定细胞凋亡与自噬的方法准确测定细胞凋亡与自噬对于理解其生物学功能非常重要。8.3.1流式细胞术AnnexinV-FITC/PI染色：区分早期和晚期凋亡细胞。JC-1染色：评估线粒体膜电位变化。8.3.2WesternBlottingLC3转化：检测LC3-II/LC3-I的比例变化。Beclin1表达：监控自噬相关蛋白水平。8.3.3电子显微镜自噬体观察：识别双层膜结构。凋亡特征：核浓缩、细胞膜皱缩。第九章：细胞骨架与运动9.1微丝与微管的功能特性细胞骨架是由微丝、微管和中间纤维组成的网络结构，对于维持细胞形态和运动至关重要。9.1.1微丝（肌动蛋白丝）主要成分：肌动蛋白（Actin）。功能：参与细胞形状维持、胞质流动和细胞分裂。9.1.2微管主要成分：α-和β-微管蛋白。功能：构成纺锤体、中心体和纤毛。9.1.3中间纤维主要成分：角蛋白、波形蛋白等。功能：提供机械支撑，参与应激反应。9.2细胞运动的分子基础细胞运动涉及复杂的信号传导和细胞骨架重组。9.2.1细胞黏附整联蛋白：介导细胞与细胞外基质之间的黏附。钙依赖性黏附分子：如钙黏蛋白，介导细胞间的直接接触。9.2.2极性建立PAR蛋白复合体：参与细胞极性的形成。Rho家族GTPase：调控细胞骨架重塑。9.2.3胞质流动肌球蛋白：与肌动蛋白丝相互作用，产生推动力。微管马达蛋白：如动力蛋白和驱动蛋白，沿微管移动。9.3荧光标记追踪细胞内动态变化荧光标记技术可以帮助科学家实时观察细胞骨架和细胞运动的变化。9.3.1GFP及其衍生物GFP：绿色荧光蛋白，常用于标记细胞内结构。mCherry：红色荧光蛋白，适用于长期追踪。9.3.2荧光共振能量转移（FRET）原理：供体与受体荧光团之间的能量转移。应用：监测活细胞内特定分子的相互作用。9.3.3荧光寿命成像显微镜（FLIM）原理：测量荧光寿命变化反映分子环境。优势：无需外部标记即可探测细胞内动态变化。第十章：细胞间相互作用10.1细胞粘附分子的研究细胞粘附分子（CAMs）在细胞间相互作用中起着至关重要的作用。10.1.1分类整合素：介导细胞与细胞外基质的黏附。选择素：参与白细胞滚动和迁移。免疫球蛋白超家族：如N-CAM，参与神经元之间的黏附。钙依赖性黏附分子：如E-钙黏蛋白，介导上皮细胞间的黏附。10.1.2功能组织发育：促进细胞聚集形成组织。免疫反应：介导白细胞与血管内皮细胞的相互作用。伤口愈合：参与细胞迁移和组织修复。10.2细胞外基质(ECM)的作用细胞外基质是细胞周围的支持网络，对于维持组织结构和功能至关重要。10.2.1主要成分胶原蛋白：形成纤维网络，提供机械支撑。弹性蛋白：赋予组织弹性。糖胺聚糖：如透明质酸，参与水分保持和润滑。10.2.2生物功能细胞黏附：提供细胞黏附的支架。信号传导：调节生长因子活性。细胞迁移：引导细胞运动方向。10.3细胞通讯与组织形成细胞间的通讯对于组织的形成和发展至关重要。10.3.1间隙连接结构：由连接蛋白组成的小孔，允许小分子通过。功能：促进相邻细胞间的信息交流。10.3.2旁分泌信号生长因子：如表皮生长因子（EGF），促进细胞增殖。趋化因子：引导细胞定向迁移。10.3.3自分泌信号细胞因子：如白细胞介素（IL），调节免疫反应。激素：如胰岛素，调节代谢过程。10.4细胞间相互作用的实验方法研究细胞间相互作用的实验方法多种多样，各有优缺点。10.4.1细胞培养共培养：不同细胞类型混合培养，模拟体内环境。三维培养：使用凝胶或支架材料，更接近自然状态。10.4.2流式细胞术表面标记：检测特定细胞表面分子的表达。细胞分离：根据表面标记分离特定细胞群。10.4.3免疫组化组织切片：固定和染色组织切片，观察细胞分布。免疫荧光：标记特定分子，显示细胞内分布。第十一章：细胞遗传学11.1细胞遗传物质的操作细胞遗传学研究如何在实验条件下操作和分析细胞内的遗传物质。11.1.1基因转移病毒载体：如腺病毒、慢病毒，高效转导细胞。非病毒载体：如质粒DNA，简单易用。11.1.2基因编辑锌指核酸酶（ZFN）：设计特定DNA结合蛋白。转录激活因子样效应核酸酶（TALEN）：更灵活的DNA识别。CRISPR/Cas9系统：基于RNA引导的DNA切割。11.1.3基因表达调控启动子构建：设计启动子控制基因表达。报告基因：如萤火虫荧光素酶，监测基因活性。11.2基因编辑技术（CRISPR/Cas9）CRISPR/Cas9技术是目前最流行的基因编辑工具。11.2.1CRISPR系统的发现自然防御机制：细菌用来抵御病毒侵袭。Cas9酶：负责切割目标DNA序列。11.2.2sgRNA设计靶标选择：选择合适的DNA序列作为切割位点。sgRNA合成：合成单链向导RNA，与Cas9结合。11.2.3应用基因敲除：删除特定基因。基因敲入：插入新基因序列。基因修复：纠正突变基因。11.3遗传信息传递与变异遗传信息的传递和变异对于理解生物进化和疾病发生机制非常重要。11.3.1遗传信息传递DNA复制：确保遗传信息的准确复制。RNA转录：将遗传信息转录成mRNA。11.3.2遗传变异点突变：单个核苷酸的改变。插入和缺失：导致阅读框的改变。重排：染色体片段的重新排列。第十二章：细胞分化与干细胞研究12.1细胞分化的基本原理细胞分化是细胞由一种类型转变为另一种类型的过程。12.1.1分化决定因子转录因子：控制特定基因的表达。信号分子：如Wnt、BMP，调节分化路径。12.1.2细胞命运决定初始状态：细胞处于未分化状态。分化过程：通过特定信号诱导分化。终末分化：形成功能特化的细胞。12.2干细胞的分类与特性干细胞具有自我更新和分化为多种细胞类型的能力。12.2.1胚胎干细胞全能性：可以分化成任何类型的细胞。来源：早期胚胎。12.2.2成体干细胞多能性：局限于特定组织或器官。来源：成体组织，如骨髓、皮肤。12.2.3诱导多能干细胞（iPS）诱导重编程：通过导入特定基因将成体细胞逆转为多能状态。应用潜力：用于疾病模型和再生医学。12.3诱导多能干细胞(iPS)技术iPS技术为细胞生物学带来了革命性的变化。12.3.1重编程因子OCT4：核心转录因子。SOX2：维持干细胞状态。KLF4：促进细胞增殖。c-MYC：调控细胞周期。12.3.2重编程方法病毒载体：常用慢病毒或逆转录病毒。非整合方法：如mRNA、miRNA、小分子化合物。12.3.3iPS细胞的鉴定形态特征：紧密聚集、平坦或圆顶状。基因表达：检测干细胞标志基因。多能性测试：分化成三个胚层的细胞。第十三章：细胞成像技术13.1共聚焦激光扫描显微镜共聚焦激光扫描显微镜（ConfocalLaserScanningMicroscopy,CLSM）是一种高分辨率显微技术。13.1.1工作原理激光光源：提供单色、高能量的光束。共聚焦针孔：滤除非焦平面的光，提高图像清晰度。13.1.2图像采集逐点扫描：激光逐行扫描样本，记录反射或荧光信号。数字成像：将光信号转换为数字图像。13.1.3应用细胞内结构：精细观察细胞器、细胞骨架。活细胞成像：长时间观察细胞动态变化。13.2超分辨率显微技术超分辨率显微技术（Super-resolutionMicroscopy）突破了传统光学显微镜的分辨率极限。13.2.1STED显微镜原理：利用STED（StimulatedEmissionDepletion）光束抑制荧光发射。优势：可达到纳米级分辨率。13.2.2STORM显微镜原理：基于随机开关单分子荧光。应用：实现高密度标记下的超分辨率成像。13.2.3SIM显微镜原理：利用结构光照明显微镜（StructuredIlluminationMicroscopy）。特点：通过干涉图案提高分辨率。13.3三维重建与定量分析三维重建与定量分析是细胞成像技术的重要组成部分。13.3.1三维重建Z轴扫描：获取不同深度的图像。软件处理：通过算法生成三维模型。13.3.2定量分析图像分割：区分不同的细胞结构。参数测量：计算细胞大小、形状等特征。统计分析：评估细胞群体的变化趋势。第十四章：细胞代谢与能量转换14.1ATP合成与利用ATP（腺苷三磷酸）是细胞的能量货币，对于维持细胞功能至关重要。14.1.1ATP的生成糖酵解：葡萄糖分解产生丙酮酸，生成少量ATP。TCA循环：丙酮酸进入线粒体，进一步氧化产生大量ATP。氧化磷酸化：电子传递链推动质子梯度形成，驱动ATP合成。14.1.2ATP的消耗主动运输：如Na+/K+泵，维持细胞内外离子平衡。肌肉收缩：驱动肌纤维收缩。合成代谢：合成大分子如蛋白质、脂肪。14.2细胞呼吸与光合作用细胞呼吸和光合作用是生物体获取能量的两种主要方式。14.2.1细胞呼吸需氧呼吸：在氧气存在下，有机物完全氧化为CO₂和H₂O。厌氧呼吸：在无氧条件下，有机物部分氧化，生成乳酸或酒精。14.2.2光合作用光反应：光能转化为化学能，产生ATP和NADPH。暗反应：利用ATP和NADPH还原CO₂，合成糖类。14.2.3能量转换效率光能利用率：光合作用中光能转化为化学能的效率。呼吸热损失：细胞呼吸过程中能量以