马铃薯黑痣病PCR检测方法

1马铃薯黑痣病菌PCR检测方法本文件规定了马铃薯黑痣病菌快速检测方法。本文件适用于马铃薯植株、块茎等组织中马铃薯黑痣病菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T8855新鲜水果和蔬菜取样方法3术语和定义下列定义适用于本文件。3.1聚合酶链式反应polymerasechainreaction，PCR是体外快速扩增特定基因或DNA序列的一种技术，它能以极少量的DNA为模版，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。3.2马铃薯黑痣病菌中文名称：立枯丝核菌俗名：马铃薯黑痣病菌拉丁学名：RhizoctoniasolaniKühn属于真菌界（Fungi）、半知菌亚门（Deuteromycotina）、丝孢纲（Hyphomycetes）、无孢目（Agonomycetales）、丝核菌属（Rhizoctonia）。立枯丝核菌引起马铃薯黑痣病，可通过病薯上或留在土壤中的菌核越冬，带病种薯是远距离传播的主要载体。马铃薯生长期间病菌从土壤中根系或茎基部伤口侵入，引起发病。3.3TaqDNA聚合酶是第一个被发现的热稳定DNA聚合酶，分子量65kD，由Saiki等从温泉中分离的一株水生噬热杆菌（thermusaquaticus）中提取获得。3.4特异性引物是某个基因序列的一部分,由一条正链引物和一条反链引物组成,在进行PCR扩增时,能从总DNA中特异的扩增出两条引物之间的序列,从而得到大量该基因的片段或全长。24原理本文件采用聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）方法检测马铃薯黑痣病菌。其原理是：以马铃薯黑痣病菌保守序列设计特异性引物，以基因组DNA为模板，在TaqDNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判断该样品中是否含有目的片段，从而达到鉴定马铃薯黑痣病菌的目的。5试剂与材料见附录A。6主要仪器见附录B。7操作步骤7.1对照的设立检测体系以马铃薯黑痣病菌的DNA作为阳性对照，以不添加DNA模板的反应体系作为阴性对照；在检测过程中要同待测样品一同进行以下操作。7.2样品制备取马铃薯植株或块茎组织0.1g，现用现取。按照GB/T8855新鲜水果和蔬菜取样方法进行。7.3马铃薯组织样品DNA提取将样品置于灭过菌的研钵中，加液氮研磨成粉末，转至1.5mL离心管。后续操作参见植物基因组DNA提取试剂盒推荐步骤进行。7.4PCR扩增7.4.1PCR扩增引物上游引物：5’-TTGGTTGTAGCTGGTCTATTT-3’下游引物：5’-TATCACGCTGAGTGGAACCA-3’扩增片段大小为500bp。7.4.2PCR反应体系按照以下顺序加入相应试剂到PCR管中，混匀并离心10s，使混合液都沉降到PCR管底。表1PCR扩增反应体系组成水32TaqDNA聚合酶（5U/uL）7.4.3PCR反应程序最后，4℃冰箱保存备用。8琼脂糖凝胶电泳使用1.5%的琼脂糖凝胶，按比例混匀DNALoadingBuffer和PCR扩增产物，用2000bpDNAMarker作为分子量标记，进行凝胶电泳。电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察，凝胶上是否出现预期大小的特异性DNA条带，并拍照记录。9结果9.1试验成立的条件阳性对照检测到预期大小的特异性扩增条带，阴性对照和空白对照没有检测到预期大小的特异性扩增条带。若阳性对照、阴性对照和空白对照同时成立时，则表明试验有效，否则试验无效。9.2结果判定若待检样品在500bp对应位置出现特异性条带，则判定样品为阳性；若待检样品在500bp对应位置没有出现特异性条带，则判定为阴性。4（资料性）试剂与材料以下所有试剂，除另有规定外，均使用分析纯试剂；水为符合GB/T6682中规定的一级水。A.1植物基因组提取。A.2TaqDNA聚合酶（5U/uL）。A.3dNTP混合物（各2.5mmol/L）。A.410×PCR缓冲液（含Mg2+）。A.5无水乙醇。A.6溴化乙锭溶液（10mg/mL）称取溴化乙锭100mg，加水溶解，定容至10mL。A.7引物缓冲液用水将上、下游引物分别配制成工作浓度为10ng/uL的溶液。A.850×TAE电泳缓冲液。A.91×TAE电泳缓冲液量取50×TAE电泳缓冲液20mL，加水定容至1L。A.101.5%琼脂糖凝胶称取1.5g琼脂糖，加入100mL的1×TAE电泳缓冲液，微波炉加热至琼脂糖融化，带溶液冷却至50℃左右时，加入5ul溴化乙锭溶液，摇匀，倒入制胶板中均匀铺板，凝固后取下梳子，备用。A.112000bpDNAM