蛋白质相互作用

蛋白质相互作用FRETELISA

蛋白质芯片SPRITCFRET现象当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子接近到一定距离（1-10nm）时，就会发生一种非放射性的能量转移，激发供体而产生的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。FRET技术原理以适当频率的光能照射供体,会有效地产生振荡偶极子,与近处的受体探针的偶极子产生共振。这种偶极子与偶极子之间的相互作用将供体荧光团的能量非放射性地转移到受体荧光团。对于特定的供体-受体对,供体丢失的能量就是受体得到的能量。Forster显示这个过程的效率依赖于供体和受体间距离六次幂的倒数:E=1/{1+(R/R0)6}(R0是一半能量发生转移的距离)，还依赖于染料的光谱特性及它们的相对方向。FRET应用FRET技术已广泛用于研究胞内及跨膜蛋白的磷酸化过程、蛋白质在胞内的折叠、蛋白质之间的相互作用等。将两种蛋白质分别使用CFP／YFP(或BFP／GFP)标记，当两者在同一细胞中表达时，只要检测到FRET发生，则证明两蛋白质问距离小于10nrn，存在相互作用。ELISA原理ELISA的类型1、双抗体夹心法将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗。检测液相中的可溶性抗原。ELISA的类型2、间接法将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗。检测液相中未知抗体。ELISA的类型3、直接法将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗体或抗原。ELISA的类型4、竞争法对照孔：酶标抗体测定孔：酶标抗体和待测抗体抗原中杂质难以去除或抗原结合，特异性不稳定eg:HBV的e抗原很容易转化为核心抗原（29氨基酸差异）显色强弱与待测抗体的含量成反比5、生物素和亲和素标记法ELISA的类型检测抗体生物素化SA标记酶ELISA的应用ELISA的优点及存在的问题高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性；高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测；定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值；使用方便，有各种各样的商业化试剂盒。样品的干扰物质多固相载体的质量不统一：原料及制备工艺不一致，不同批号的固相载体有时本底值较高，有时吸附性能差，影响实验结果对ELISA法的非特异性难以评价试剂无统一标准优点存在的问题蛋白质芯片蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点。1、检测型蛋白质芯片将不同类型的配体，包括抗体、抗原、核酸、肽、有机小分子、糖类分子或者一些具有高度亲和力的特异性识别分子固定在修饰化的固相基质表面上，靶标蛋白存在于溶液中，用于芯片分析。这类芯片主要用于监测靶标蛋白的含量、表达水平、蛋白质在细胞和组织中的分布及对诊断标志物的分析，即蛋白质表达谱(定量)的分析。2、功能型蛋白芯片它的识别分子主要是通过高通量的蛋白纯化、人工合成多肽或化学分子制备而成，然后将其点在合适的固相基质表面。这类芯片主要适用于蛋白质的生化功能以及相互作用研究，如蛋白质的结合特性、酶的催化活性、蛋白质转录后修饰的研究、小分子药物和药物靶标的筛选和鉴定等，即蛋白质与蛋白质及其他分子相互作用谱图的研究网蛋白质芯片的分类蛋白质芯片制作的基本流程(1)蛋白质芯片在制作过程中实验条件发生微小的变化可能引起最后结果的不同，条件不易控制，实验结果可重复性相对不足。(2)目前用于蛋白质芯片制备的固相介质(如化学膜、凝胶和玻片)都存在一些缺点，蛋白质在固相基质表面的固定往往会造成其解折叠，从而失去生物活性。(3)对结果的扫描、背景去除、数据处理等还不圆满，会导致假阳性、假阴性的存在。蛋白质芯片技术存在的问题SPR(等离子表面共振技术)SPR原理将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。SPR技术特点1、无需标记，避免了费时而昂贵的纯化和标记2、实时检测3、样品用量少(1ug)4、检测灵敏度高（C<0.01ng/ml）5、无损伤检测6、快捷方便需预先制备传感器芯片ITCITC（等温滴定微量热技术）是一种监测由结合成分的添加 而引起的任何化学反应的热力学技术，它已经成为鉴定生物 分子间相互作用的重要方法。

当物质相互作用时，热量要么产生，要么吸收。ITC直接测量生物分子结合事件中释放或吸收的热量，获得生物分子相互作用的完整热力学参数，包括结合常数、结合位点数、摩尔结合焓、摩尔结合熵、摩尔恒压热容，和动力学参数(如酶活力、酶促反应米氏常数和酶转换数)。ITCITC获取的结果示意图上图：峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量。下图：以产生或吸收的总热量为纵坐标，以加入杯中的两反应物之摩尔比为横坐标作图，可得整个反应过程的结合等温曲线。ITC具有的特点1、它不干扰蛋白质和核酸的生理功能，具有非特异性的独特优势，即对被研究蛋白质和核酸体系的溶剂性质、光谱性质和电学性质等没有任何限制条件。2、样品用量小,方法灵敏