DB34∕T 2560-2015 窖泥微生物群落结构快速定量测定 PSP-qPCR绝对定量法　　

窖泥微生物群落结构快速定量测定QuicklydetectionmethedtoquantifypitsmudmicrobialcommHYPERLINK安徽省质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省浓香型白酒标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：安徽瑞思威尔科技有限公司、安徽古井贡酒股份有限公司、哈尔滨工业大学。本标准起草人：何宏魁、周庆伍、李安军、刘国英、余秀娟、汤有宏、葛向阳、张会敏、蒋军、聂加燕。1窖泥微生物群落结构快速定量测定PSP-qPCR绝对定量法本标准规定了一种基于门特异性引物测定窖泥微生物群落结构组成的快速定量优化方法。本标准适用于窖泥中微生物群落结构的快速定量检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。门特异性引物phylum-specificprimers,PSP指特异性扩增某个门的所有微生物基因序列所共有且相对于其余门的微生物基因序列所独有的基因序列的引物对，由一条正向引物(5’→3’)和一条反向引物(3’→5’)组成。荧光定量PCRquantitativePCR,qPCR又称real-timePCR,荧光反转录-聚合酶链反应。3.3HYPERLINK是一种亚克隆方式，在连接酶存在的情况下，依赖DNA链两端的腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的互补作用，将不同DNA链连接。2实时荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR过程。将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，进而根据未知样品的Ct值在标准曲线的位置得到未知样品中目标序列的初始拷贝浓度的方法。采用SAP技术(单碱基差异原则)设计门特异性引物，在引物的3’端为单核苷酸多态性位点，当在引物3'末端倒数第二个碱基引入错配后，若最后一个碱基是强配对碱基，则此种情况下引物仍可以与模板配对并延伸。5试剂和材料5.1本标准中所用的水，除文中提到的ddH₂O属于经过两次蒸馏的双蒸水以外，其他实验室用水均指符合GB/T6682中要求的三级水。所述溶液，在未特别注明，均指水溶液。5.3胶回收试剂盒。5.4TA克隆试剂盒。5.5大肠杆菌感受态细胞。5.6PCR试剂盒。5.7qPCR试剂盒。5.9细菌16SrDNA扩增引物。6仪器和设备6.1紫外核酸检测仪。6.2荧光定量PCR仪。6.4凝胶成像系统。6.5高速冷冻离心机。6.6冰盒。6.7移液枪。6.8八连管离心机。7测定步骤7.1门特异性引物设计37.1.1样品总DNA的提取、细菌16SrDNA的PCR扩增、克隆文库的构建及阳性克隆的筛选提取窖泥样品中的基因组总DNA(按5.2说明书的方法),以此为模板扩增接近全长的16SrDNA。选择扩增引物，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，将指定片段的条带切胶回收纯化(按5.3说明书的方法),然后进行TA克隆(按5.4说明书的方法),连接产物进行转化(按5.5说明书方法),后进行蓝白斑筛选，获得一定数目的有效克隆²。7.1.2克隆测序、序列分析有效克隆经过DNA测序，得到双向测序序列，利用拼接软件完成双向序列拼接，去掉来自克隆载体的多余序列。经过相应网站(见编制说明)的进行比对，确定与已知序列的同源关系。将结果相同的序列归为一个0TU(Operationaltaxonomicunit)。可进一步通过将各0UT的未知代表序列和已知标准菌的序列一起建立系统发育树的方式确认彼此之间的亲缘关系。把相同的门归在一起，不同的门之间的序列差异通过SAP技术处理³,这些引物对以每个门的实际16S序列的TA克隆纯质粒为模板进行PCR(按4.5说明书的方法)验证及所有门混合模板验证，以不含引物二聚体或极少二聚体，得到门特异性引物序列⁴。7.2群落结构定量方法-PSP-qPCR绝对定量法7.2.1普通PCR引物筛选实验b)选择出来的引物扩增对应门的16SrDNA序列和非对应门的16SrDNA序列。模板选择使用TA克隆质粒。选择能够正确扩增目标序列的引物(选择引物的原则是所选引物能正确扩增目标序物选择保留)。7.2.2qPCR预实验经普通PCR试验筛选出的PSP引物进行qPCR预实验5(按5.7说明书的方法)。检查扩增曲线和溶解曲线。溶解曲线中，只有PCR产物所产生的峰，没有引物二聚体峰存在。同时做空白对照(以ddH₂O为模板)和阴性对照⁶(以非目标质粒为模板),确保没有扩增曲线产生，即中，尤其是扩增循环的后面几个循环。即这种情况下，实验样品扩增曲线和溶解曲线正常，空白对照的溶解曲线只有引物二聚体的峰，阴性对照只有非目标产物峰或者引物二聚体峰。47.2.3质粒标准品的制备质粒标准品可以是纯化后的PCR产物，也可以是含有PCR产物的质粒。本标准中选用含有PCR具体制备过程参考附件B。7.2.4.1qPCR扩增体系基因组模板(来自于样品中，记为N组)、引物(待测定门的特异性引物)、TaqDNA聚合酶、qPCR缓冲液(含dNTP和Mg²)、ddH₂O(灭菌)、制备好的质粒(用作qPCR标准品)。7.2.4.2质粒标准品的梯度稀释1)准备10个无菌的1.5mL的离心管，每管中加入18μL的双蒸水，吸取质粒原液2μL加入到第1管中，然后用手指弹匀，离心甩下来(转速达到5000rpm立即停止);再弹匀甩下来，这样每个稀释液弹匀离心两次，得到10-¹稀释液。2)再在第一个管子中吸取2μL到第2管中，如前操作，得到10²稀释液。3)如操作1)、2),计稀释8个梯度，即梯度稀释至10-⁸。4)然后使用最后6个梯度进行QPCR定量，舍掉10-¹和10-²两个梯度。qPCR体系的配制包括标准品和未知样品的配制。——MixI是不含模板的所有.qPCR试剂的混合物(包括qPCRbuffer,(含荧光物质)、Primers、a)配制标准品MixI首先计算配制Mix的管数：比如说，某试验需要6个梯度稀释的标准品做标准曲线，测一个未知样品的浓度，同时试验中设置一个阴性对照。6组梯度+1组基因组+1NTC(对照)=8组；每组实验3个平行，故计需配制组数N= (8+1)×(3+1)=36管²。所以，配置MixI的时候需要配相当于36管的试验量的MixI。5按5.7说明书，配制12μL体系(12μL体系不是不可更改的，可按照试验要求，按照比例更改试验体系的体积为25μL或者50μL),如表1:表1PCR扩增体系qPCRbuffer(含荧光物质)Taq酶：基因组：b)配制标准品MixⅡ准备8个无菌的1.5mL的离心管，用于配制8组反应液。按5.7说明书，配制12μL体系，如表2:表212μLPCR扩增体系c)八连管分装按表3位置分装：(注：表3所图示为ABI-Stepone48孔qPCR仪器的排布，实际试验中根据所使用的仪器型号可能排布方式不同，只要保证qPCR仪器程序设置的顺序和加样顺序一致即可。)表3八连管分装位点注1:S-5℃~S-10:选择的6个稀释梯度；注2:N①、N②:待测样品，不限于两个；7.2.5qPCR程序的设定与运行PCR扩增程序分为扩增曲线部分和溶解曲线部分，具体程序设定方法参考附件C。7.2.6通过溶解曲线确认产物的正确性6在方法建立过程中，扩增产物的纯度和质量要通过琼脂糖凝胶电泳检测。扩增条件优化后实际进行测定时无需每次再进行产物的检测；通过观察溶解曲线，如果没有出现引物二聚体峰，扩增产物峰单一，并且产物Tm值与标准品的Tm值一致即可。7.2.7优化标准曲线通过选择标准曲线中合适的标准品的梯度稀释点，以及调整Ct值，阈值等参数，保证标准曲线的参数R²值大于0.99。7.2.8结果计算在标准曲线上根据未知浓度样品的Ct值得到对应的浓度值。7(资料性附录)A.1引物选择扩增引物为细菌16SrDNA的通用引物：27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492RA.2建立PCR反应体系根据引物的退火温度和PCR产物的长度，设定PCR反应程序，如：PCR反应程序：94℃预变性5min、94℃30s、55℃30s、72℃30s,38个循环，7延伸5min。得到PCR扩增产物。HYPERLINK8(资料性附录)B.1将作为PCR标准品的PCR产物，扩增后，电泳，切胶纯化。B.2通过TA克隆将纯化后的PCR产物跑电泳照相，确认其浓度足够。B.3质粒转化：配置载体连接体系：Vetor(pMDOR-19T,TakμL;纯化的PCR产物片段2.5μL;SolutionI:3μL(务必保证前两者的体积之和等于Solution置连接1-4个小时。B.4连接完后，转入感受态大肠杆菌DH5a中。(可以查看相关产品说明书)1)将连接好的6μL质粒首先在冰水混合物中预冷，然后向其中加入40μL的感受态细胞。2)冰上放置40min,42℃培养5min。3)之后加入1mLLB培养基液体，37℃振荡培养45min。4)培养完毕后倒板。平板为LBA培养基又加上了X-gal(40μL,20mg/mL,2%)和IPTG(70μL,20mg/mL,胞经历相同的操作后，在不添加抗生素的LBA平板上进行倒板就可以了。两个样品在4菌落，或者菌落数量太少得不到足够的单菌落。)5)铺好的板，等完全晾干后，于37℃过夜培养。培养大约16个小时后观察结果。B.5通过蓝白斑筛选挑取白斑即是转化成功的细胞。a)使用质粒提取试剂盒提取质粒然后酶切验证，可以使用HindIIIandEcoRI组合37℃酶切2大小是2692bp,下带就是连接产物的大小，根据下带确定连接体的大小正确与否。b)做菌液PCR,直接把很少的白斑菌挑出来，挑到50μL无菌水中，沸水煮3min,12000rpmB.7提取质粒，测定质粒浓度和质量，测量浓度的同时，通过Abs260/Abs280质量，在1.8最好，在1.7-1.9之间即可做标准品了。9660个碱基对的平均分子量是660,单位为daltons/bp。HYPERLINK(资料性附录)qPCR体系配制与程序设定实例C.1选择样本在同一地点平行取4个样品，并编号，混合。按表C.1的方法记录混合样品。混合样品混合样品AGBICLDJFME0KNHPC.2.112μL实验体系为(12μL试验体系并不是固定不变的，通常如果试验量小的话，25μL体系和50μL体系使用比较多；在本试验中由于试验量比较大，改为12μL体系，以节省成本。如果想改试验体系的话，各成分按比例修改即可。不过Taq酶的用量一般按照比例增大后须适当减少，因为过量的Taq酶容易导致二聚体的产生，以及错配的产生，缺少部分用ddH₂O补齐即可。):见表C.2。表C.2反应体系qPCRbuffer(含荧光物质)Primers(门特异性引物)其中质粒标准品设置7个梯度，为10-4→10-10。C.2.2引物：使用特别设计的门特异性引物。C.2.3标准样品：N个门各自的质粒作为各自标准品。N个门分别单独完成qPCR实验。以拟杆菌门为例数据提供如下：对Bacteroidetes门特异性引物进行绝对定量Q-PCR检测与分析，4个混合样本的编号是①ABCD②EFHK③GIHK④MNOP,Bacteroidetes门对应的特异性引物是302-321C.3实验过程C.3.1