哺乳动物构建动脉粥样硬化全人源初级抗体库分析研究 临床医学专业

讨论抗体作为人类免疫系统的重要组成部分，成为了当下医学研究工作者的热门研究对象。抗体的发展经历了以下发展过程。第一代抗体是血清多克隆抗体。第二代抗体是由1975年英国科学家Milstein和KohlerADDINNE.Ref.{C4E77045-9CAE-421D-A3AC-70E1431A5B14}[31]所用B细胞的骨髓瘤细胞系通过杂交瘤技术生产的单克隆抗发明的杂交瘤技术产生的单克隆抗体。继重组蛋白后，单克隆抗体已成为生物医药领域的重要部分，由于其靶向性强、疗效好、副作用小等优点而被广泛研究和使用。在疾病的治疗上，其应用广阔，已被成功用于治疗各系统的疾病，如心血管系统，呼吸系统，血液系统，肾脏，免疫系统、肿瘤、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病ADDINNE.Ref.{C0A50E05-F538-4699-B329-84E9ABE4E48C}[32]。单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位。单克隆抗体的发展经历了四个阶段，最先出现的是鼠源性单克隆抗体；随后便是嵌合性单克隆抗体；再后来是人源化单克隆抗体；目前则是全人源单克隆抗体。通过杂交瘤技术获得的单克隆抗体是鼠源性抗体，在应用于人体体内时，存在着诱发人抗鼠抗体反应(humananti-mouseantibodyHAMA)的风险，安全性较差。且鼠源性单克隆抗体在人体应用时，无抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）和补体依赖性细胞毒作用（CDC）等相关的免疫效应，应用受到了限制。后来，研究人员利用分子生物学技术对杂交瘤的鼠源抗体进行了改造，便获得了人-鼠嵌合抗体和重构抗体。第三代抗体是基因工程抗体，主要包括人鼠嵌合抗体、人源化抗体、完全人源抗体、单链抗体、双特异性抗体等。它是随着DNA重组技术的飞速发展和抗体基因结构功能的发现而出现的，它的出现是抗体生产技术的又一次重大突破，进一步拓展了抗体的应用范围ADDINNE.Ref.{DBBB799F-70E2-461C-AE09-F48910BED7F9}[33,34]。它的出现降低了免疫原性、提高了抗体亲和力、延长了抗体在体内的半衰期。展显出了许多杂交瘤技术产生的单克隆抗体不具有的优点。特别是全人源化的单克隆抗体，其抗体的可变区和恒定区都是来自人的，没有免疫原性，已被广泛应用。全人源抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EB病毒（EBV）转化B淋巴细胞技术、噬菌体展示技术（phagedisplay）、转基因小鼠抗体制备技术（transgenicmouse）和单个B细胞抗体制备技术等。通过这些技术制备的全人源抗体药物，其亲和力高、特异性高、毒副作用小，克服了以往的各种单克隆抗体的缺点，成为了治疗性抗体药物发展的必然趋势。抗体库及抗体展示技术是当前生产单克隆抗体的重要技术ADDINNE.Ref.{5E8C5A42-E278-4CC1-B797-75E976F60145}[35]。包括了噬菌体展示、核糖体展示、细菌展示、酵母展示等多种抗体展示技术ADDINNE.Ref.{7F55EBC9-7B49-4EF7-A54F-7A750059CDA2}[36,37]。其中，又以噬菌体展示ADDINNE.Ref.{45966BC8-DE60-4B78-9EC9-F5A4351DFB7F}[38]抗体库及其筛选技术应用最广、发展也较成熟。构建噬菌体展示抗体库的步骤如下：首先，采集供者的免疫组织(如外周血淋巴细胞、脾细胞等)，设计抗体重链和轻链基因序列的PCR引物、采用RT-PCR扩增抗体可变区基因，插入噬菌体表达载体后构建抗体基因库；其次，将该抗体基因库克隆至适当的噬菌体颗粒的外壳蛋白上的适当位置，即可获得噬菌体展示抗体库。随后，用抗原与展示该抗体的噬菌体颗粒反应，得到了能够识别抗原的噬菌体颗粒文库；将这些噬菌体颗粒文库感染大肠杆菌宿主进行扩增，通过数轮“抗原与噬菌体颗粒结合、非特异性抗体洗涤、特异性抗体的洗脱和扩增”的淘选过程，再利用突变和链置换的方法即可获得高特异性的抗体ADDINNE.Ref.{DE293641-D3C9-47A4-B504-40571242F88A}[39]。虽然利用噬菌体展示技术在某种程度上推动了抗体研究的进步，得到了全人源的单克隆抗体，成功避免应用传统杂交瘤技术获得的鼠源单克隆抗体在人体内应用时诱发的人抗鼠抗体反应(HAMA)。然而，噬菌体展示技术也有许多缺点。在噬菌体展示过程中要经历转化细菌，以及噬菌体包装等过程，一定程度上降低了库的容量和多样性，容量一般限制在109。另一方面，噬菌体是一种原核生物，其蛋白质的表达机制与真核生物蛋白质的表达机制存在着差异；所获得的特异性单克隆抗体必须转入到哺乳动物细胞中，才能进行抗体的大量生产。这种差异的存在，导致在噬菌体中高表达的抗体蛋白不能在哺乳动物细胞中获得很好的表达。再者，一旦成功构建了噬菌体库，就很难在体外进行重组和突变，大大降低了遗传多样性。最后，噬菌体展示系统表达的抗体仅是抗原结合片段(Fab)或单链可变区抗体片段(scFv)等小分子抗体，无法展示并筛选全长抗体。因此，以上缺点限制了噬菌体抗体展示技术在抗体生产中的应用。哺乳动物细胞表面展示系统是目前抗体工业生产与制备最常用的抗体表达系统。哺乳动物细胞的蛋白质折叠和转录后修饰与人体一致，在生物学功能、理化性质和分子结构等方面，其表达的抗体更接近天然的蛋白质。而且，该系统展示的抗体是完整的全长人源抗体。因此，哺乳动物细胞展示系统成为目前筛选人源抗体最理想的技术。近年来，研究人员发现要实现哺乳动物细胞抗体的展示必须满足抗体能够展示在细胞膜表面。通过在载体上插入融合血小板衍生生长因子受体（Platelet-derivedgrowthfactorreceptors，PGF-R）跨膜(transmembranedomain,TM)序列ADDINNE.Ref.{14C2B308-8BCB-49CF-A21F-308676760D4B}[40]，即可使抗体锚定在哺乳动物细胞表面。本研究通过把载体pcDNA5-FRT/XXX改造位pcDNA5-VH-TM，在其Fab抗体重链末端连接PDGF-R跨膜区序列便于抗体展示在细胞膜表面。随后又构建了哺乳动物细胞全人源表达载体pcDNA-DHL，优化了基因克隆等实验条件ADDINNE.Ref.{19F79F3D-EF90-4066-9018-C2465BD5CD59}[41]建立了大容量的全长抗体基因库。为特异性全长抗体的直接筛选奠定了基础。库的容量和多样性是衡量一个抗体库质量的重要参数，建立库容量大、多样性好的抗体库是筛选获得特异性抗体的前提条件ADDINNE.Ref.{A7875D82-4655-4A2F-90B1-882FEDA437C4}[42,43]。为了保证库容量足够大、不在实验过程中降低抗体库的多样性，本研究在构建哺乳动物细胞表达载体时选择了非回文结构的限制性内切酶BsmBI和SfiI。这两种内切酶酶切时形成的粘性末端(表1-1)是非回文结构的ADDINNE.Ref.{66DA87E0-F1A9-4608-A289-7970401A772F}[44]，不会发生自我连接，能够保证各片段之间正确、高效率地连接，从而大大提高了抗体库构建过程中的连接效率，保证了抗体库的质量。而其他构建抗体库时常用的限制性内切酶如HindIIl，BamHl，NheI，XhoI，SaII，NotI等，切割后会形成回文结构，发生自我连接，从而降低了连接的效率。表1-1在pcDNA-DHL中所选用的两种酶的末端序列Tab1-1EndingsequenceofthetwoenzymesusedinpcDNA-DHLBsmBI5'-CGTCTCTAGTCC-3'3'-GCAGAGATCAGG-5'SfiI5'-GGCCACATAGGCC-3'3'-CCGGTGTATCCGG-5'接下来我们将全长人源抗体基因库(pcDNA-DHL)的质粒DNA转染293F细胞，并利用流式细胞仪进行了检测。从图1-3可见，在39.2%的293F细胞表面检测到了抗体表达。当我们同时转染了抗体重链基因库和轻链基因库时，有27%的细胞表面可检测到抗体表达。但是，当只转染了轻链基因库，而没有转染重链基因库时，细胞表面没有检测到抗体表达。发生此结果是因为在瞬时转染轻链基因库时，由于没有重链基因库，而跨膜序列在重链基因库中，因而在细胞表面检测不到抗体表达。如果能够在细胞表面检测到抗体表达，说明同时有重链的存在。因此，在用流式细胞仪进行检测的时候，用抗轻链的抗体进行标记，可以定量分析全长抗体在细胞表面的表达情况。以上结果表明，本研究构建的哺乳动物细胞全长人源抗体库中的全长抗体可以成功地展示在293F细胞的表面。为下一步构建动脉粥样硬化全人源二级抗体库奠定了基础。第二部分构建动脉粥样硬化全人源初级抗体库实验方法（一）抗体轻链K型全长基因各亚型和重链可变区基因各亚型的扩增1.抗体重链可变区各亚型基因的扩增以人外周血淋巴细胞来源的cDNA为模板，用特异性引物（vhF1~vhF6）的混合物扩增重链各亚型可变区基因片段，PCR体系为外周血淋巴细胞来源的cDNA0.5ul5’引物VHF混（10mmol/L）2μL3’引物VHR混（10mmol/L）2μL去离子水20.5μL2×GoTaqGreenMasterMix25μL总体积50μLPCR扩增条件：95℃5min；95℃15s，65℃15s，72℃30s，35个循环；72℃2min；16℃hold。扩增结束后，1.5%琼脂糖凝胶电泳证实条带位置正确。于紫外灯下，用洁净手术刀片，切取相应大小的片段条带。参照Promega琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书，回收纯化轻重链各亚型的可变区，Biodrop仪器检测回收DNA条带的浓度及260/280比值，-20℃保存备用。2.抗体轻链K型全长各亚型基因片段的扩增以人外周血淋巴细胞来源的cDNA为模板，用特异性引物（ckF1~ckF6）混合物扩增轻链全长各亚型基因片段，PCR体系为外周血淋巴细胞来源的cDNA0.5ul5’引物CKF（10mmol/L）2μL3’引物CKR（10mmol/L）2μL去离子水20.5μL2×GoTaqGreenMasterMix25μL总体积50μLPCR扩增条件：95℃5min；95℃15s，56℃15s，72℃30s，35个循环；72℃2min；16℃hold。扩增结束后，1.5%琼脂糖凝胶电泳证实条带位置正确。于紫外灯下，用洁净手术刀片，切取相应大小的片段条带。参照Promega琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书，回收纯化轻链全长各亚型基因片段，Biodrop仪器检测回收DNA条带的浓度及260/280比值，-20℃保存备用。（二）哺乳动物细胞表面展示载体pcDNA5-VH-TM、pCDNA5-CK及重链可变区各亚群和轻链全长各亚群PCR产物的酶切。1、AgeI-HF和XhoI内切酶酶切载体pcDNA5-VH-TM质粒pcDNA5-VH-TM(4ug)CutsmartBuffer10μLAgeI-HF2μLXhoI2ul去离子水XμL总体积100μL反应条件：37℃条件下反应60min。酶切结束后，1%琼脂糖凝胶电泳得到两个条带，说明酶切充分，紫外灯下切下较长的目的片段即载体骨架区片段。参照Promega琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书，Biodrop检测回收DNA条带的浓度及260/280比值，-20℃保存备用。2．用AgeI-HF和XhoI内切酶酶切载体pCDNA5-CK质粒pcDNA5-CK(4ug)CutsmartBuffer10μLAgeI-HF2μLXhoI2ul去离子水XμL总体积100μL反应条件：37℃条件下反应60min。酶切结束后，1%琼脂糖凝胶电泳得到两个条带，说明酶切充分，紫外灯下切下较长的目的片段即载体骨架区片段。参照Promega琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书，Biodrop检测回收DNA条带的浓度及260/280比值，-20℃保存备用。3．AgeI-HF和XhoI内切酶酶切重链各亚型可变区PCR产物重链各亚型可变区基因1ugCutsmartBuffer2.5μLAgeI-HF0.5μLXhoI0.5ul去离子水XμL总体积25μL反应条件：37℃反应60min。酶切结束后，1.5%琼脂糖凝胶电泳证实条带位置正确。用DpnI酶1ul，37℃，30min先降解模板，80℃，20min使酶失活后直接回收，Biodrop仪器检测回收DNA条带的浓度及260/280比值，-20℃保存备用。4.用AgeI-HF和XhoI内切酶酶切轻链全长各亚群PCR产物轻链全长各亚群PCR产物(1ug)CutsmartBuffer2.5μLAgeI-HF0.5μLXhoI0.5ul去离子水XμL总体积25μL反应条件：37℃，60min。酶切结束后，1.5%琼脂糖凝胶电泳证实条带位置正确。用DpnI酶1ul，37℃，30min先降解模板，80℃，20min使酶失活后直接回收，Biodrop仪器检测回收DNA条带的浓度及260/280比值，-20℃保存备用。（三）目的基因片段与载体的连接1、抗体轻链全长各亚型基因与酶切后载体pcDNA5-CK的连接将酶切后的轻链全长各亚型基因片段插入到pcDNA5-CK载体的相应酶切位点之间，获得了可以表达抗体轻链库的载体pcDNA-ck。连接时插入片段与载体的摩尔比为3:1，其连接反应体系为:T4DNAligase2.5μL10×T4ligaseBuffer5μLpcDNA5-CK333ng酶切后轻链全长各亚型片段72ng去离子水XμL总体积50μL2、抗体重链可变区各亚型基因与载体pcDNA5-VH-TM的连接将酶切后的重链可变区各亚型基因片段插入到pcDNA5-VH-TM载体的相应酶切位点之间，以获得可以表达抗体重链库的pcDNA-vh。连接时插入片段与载体片段的摩尔比为3:1，其连接反应体系为:T4DNAligase2.5μL10×T4ligaseBuffer5μLpcDNA5-VH333ng酶切后重链可变区各亚型片段72ng去离子水XμL总体积50μL（四）转化感受态大肠杆菌建库：取适量上述两个连接混合物体系冷却反应液，加入100ul感受态细胞中，混匀，冰上放置30min，42℃热激45-90s，冰水浴2min，加入900ulLB培养基，37℃孵育10min复苏，37℃摇菌45min。取100ul菌液涂于平板上，剩余菌液3000rpm，5min离心后，弃大部上清，混匀涂于板上，倒置，37℃过夜。随后用液态培养基回收培养板上的细菌菌落，离心、弃上清，提质粒，此为全长人源初级抗体库pcDNA-vh和pcDNA-ck。（五）抗体库的挑克隆与测序鉴定分别在所构建的重链初库pcDNA-vh与轻链初库pcDNA-ck的菌落中，各随机挑取10个单克隆菌落，在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中扩增后交华大基因公司进行基因测序分析。三、结果1、DNA片段的酶切及电泳纯化（1）、质粒pcDNA5-VH-TM的酶切及电泳纯化使用限制性内切酶AgeI-HF和XhoI双酶切质粒pcDNA5-VH-TM后，在1%琼脂糖凝胶中进行电泳、分离纯化。从图2-1中可见，质粒pcDNA5-VH-TM酶切后生成两个片段，回收其中的大片段（约5kb大小），为载体骨架片段。（2）重链可变区基因VH的酶切及电泳纯化使用内切酶AgeI-HF和XhoI双酶切重链各亚型可变区基因片段后，在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳、分离纯化。从图2-2中可见，抗体重链各亚型可变区基因片段酶切后生成两个片段，回收其中约380bp的片段。（3）质粒pcDNA5-CK的酶切及电泳纯化使用内切酶AgeI-HF和XhoI双酶切质粒pcDNA5-CK后，在1%琼脂糖凝胶中进行电泳、分离纯化。从图2-3中可见，质粒pcDNA5-CK酶切后生成两个片段，回收其中的大片段（约5kb），为载体骨架片段。（4）轻链全长基因的酶切、纯化使用内切酶AgeI-HF和XhoI酶切轻链各亚型全长基因后，在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳、分离纯化。从图2-4中可见，抗体轻链各亚型全长片段酶切后生成两个片段，回收其中约700bp的片段。2、抗体库的库容量酶切后抗体重链基因和轻链基因分别与经AgeI-HF和XhoI双酶切的载体pcDNA5-VH-TM和pcDNA5-CK由T4DNA连接酶连接，转入感受态DH5α细胞中。倍比稀释后均匀涂布于带有氨苄青霉素抗性的LB培养板上，计数生长密度均匀的培养板上长出的克隆，计算出所构建的重链基因初级抗体库容量为1.79×105，轻链基因初级抗体库容量为1.8×105。随机从重链初库和轻链初库中分别挑取10个单克隆进行基因测序分析，结果显示，在重链初库的10个单克隆中有8个克隆的编码序列是正确的，编码8个特异的氨基酸序列；轻链初库的10个单克隆中有9个克隆的编码序列是正确的，编码9个特异的氨基酸序列。理论上抗体库的多样性可以达到2.3x1010[（1.79x105x80%）X（1.8X105X90%）]。3、讨论抗体的制备随着医学生物学的不断发展也在不断优化，人工生产的抗体已经广泛应用于生物医学乃至其他各个领域，为人类治疗疾病提供了新的治疗方法ADDINNE.Ref.{46283BB7-65AA-4BB8-9945-05A00B84F549}[49]。其中，抗体以单克隆抗体为主，单克隆抗体的演变经历了从杂交瘤技术、抗体库技术到抗体展示及筛选技术等多个阶段ADDINNE.Ref.{5F51579D-9D32-4073-8CA0-23F1ECA187F6}[26]。早期通过杂交瘤技术得到的单克隆抗体，由于在治疗疾病过程中会引起人抗鼠抗体反应的危险，因而限制了其使用。后来发现的抗体库及抗体展示技术，使研究人员们制备出了全人源序列的单克隆抗体。这一发现直接减少了抗体的免疫原性，消灭了其他抗体诱发的HAMA反应，降低了抗体的毒副作用。因此，要大规模生产治疗性抗体，获得全人源抗体则是解决这一问题的必要条件ADDINNE.Ref.{15A27793-344B-4519-A5C4-1CFFF6D2FF61}[50]。而抗体库的库容量，多样性大小决定了是否能筛选出高亲和力的抗体。当库容量达到109-1010时就有可能筛选出高亲和力的抗体了，此时的亲和力相当于二次免疫反应ADDINNE.Ref.{CC7AF5A0