葡萄糖氧化酶在单胃动物减抗中的应用及制剂工艺改进初探

葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase，E.C.1.1.3.4，GOD），又称为β-D-葡萄糖氧化还原酶，是用金黄色青霉菌进行深层通风发酵，精制而得。用点青霉和黑曲霉也可以制得。葡萄糖氧化酶广泛用于葡萄酒、啤酒、果汁等食品脱氧、面粉改良、防止食品褐变等方面，在食品快速检测及生物传感器上也广泛应用。由于微生物生长繁殖快、来源广，是生产GOD的主要来源，主要生产菌株为黑曲霉和青霉。1GOD的抗氧化作用机制GOD在有氧条件下能专一性地催化β-D-葡糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，消耗分子氧或原子氧氧化葡萄糖，保护食品中的易氧化成分。按反应条件GOD催化反应有3种形式；（1）没有过氧化氢酶存在时，每氧化1mol葡萄糖消耗1mol氧；（2）有过氧化氢酶存在时，每氧化1mol葡萄糖消耗1/2mol氧；（3）有乙醇及过氧化氢酶存在时，过氧化氢酶可用于乙醇的氧化，每氧化1mol葡萄糖消耗1mol氧；GOD对β-D-葡萄糖表现出强烈的特异性，葡萄糖分子C(1)上的羟基对酶的催化活性至关重要，且羟基处于β位时的活性要比在α位时高约160倍。葡萄糖氧化酶对L-葡萄糖和2-O-甲基-D-葡糖则完全没有活性。2GOD的酶学性质高纯度GOD为淡黄色晶体，易溶于水，可制成液体制剂。GOD完全不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等有机溶剂。GOD相对分子质量在1.5×105左右，含2分子黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。pH作用范围3.5～6.5，最适pH5.0左右，在没有保护剂存在的条件下pH＞8.0或pH＜3.0时会迅速失活。GOD的作用温度范围为30～60℃。固体酶制剂在0℃下至少可保存2年，-15℃下可保存8年。3葡萄糖氧化酶（GOD）对动物的有益作用3.1清除分子氧应用于动物时酶（GOD）的催化作用是使消化道内分子氧减少，有利于肠道厌氧环境的维持，促进厌氧有益菌的生长。3.2酸化作用胃肠道的pH会影响蛋白酶原转化为蛋白酶的过程及消化酶的活性，进而影响饲粮的消化率。葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖生成的产物葡萄糖醛酸（GA）是一种有机弱酸，可作为益生元改变肠道菌群，其经微生物继续发酵产生的乙酸、丁酸等短链脂肪酸（SCFA）可以进一步降低肠道pH；葡萄糖醛酸（GA）在体外系统中可调节盲肠菌群，增加SCFA的产生，降低氨的浓度。3.3体外试验证明葡萄糖氧化酶（GOD）对多种致病细菌、真菌都有抑菌作用。且对一些植物病原菌引起的植物病害也有预防和治疗效果。该抑菌原理主要是依靠催化反应产生的过氧化氢完成，通过引起细胞质过氧化、干扰细胞内电子传递系统、破坏蛋白质分子结构或损伤遗传物质等方式影响细菌和真菌的正常生理功能。3.4葡萄糖氧化酶（GOD）在动物养殖中的应用效果3.4.1改善生产性能在断奶仔猪、哺乳母猪、肉鸡、肉鸭日粮中添加60～200U/kg的葡萄糖氧化酶（GOD）可以提高动物的平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）,料重比（F/G）进而提高整体的饲料转化率。同时改善肉禽肉质。3.4.2改善繁殖性能李嘉辉等研究表明产蛋后期蛋种鸡饲料添加350～500mg/kg葡萄糖氧化酶（GOD）后，产蛋率、种蛋蛋壳厚度和哈氏单位显著增加，料蛋比显著降低；孙颖雪、Sun等研究表明葡萄糖氧化酶（GOD）可以提高妊娠母猪后期平均采食量（ADFI）以及断奶7d发情率，降低母猪泌乳期背膘损失，并显著提高断奶时仔猪窝重。3.4.3改善机体免疫水平饲料中添加适宜剂量的葡萄糖氧化酶（GOD）可以改变动物的免疫器官指数、血或肠道中细胞因子（IFN-α、γ干扰素、IL-2白细胞介素）和抗体的含量或表达水平，由此改善机体的免疫水平。3.4.4改善肠道健康葡萄糖氧化酶（GOD）可以改善肠道屏障功能，促进受损的肠绒毛修复，进而改善肠道形态；通过产生厌氧环境抑制有害菌繁殖，维持肠道菌群平衡。添加葡萄糖氧化酶（GOD）还可以改善动物抗氧化能力，缓解热应激、缓解动物霉菌毒素中毒；陈成等的研究表明断奶仔猪饲料中添加30mg/kg活性为1000U/g的葡萄糖氧化酶（GOD）可以替代3000mg/kg氧化锌，经济效益显著，且完全避免了锌对环境的污染。尽管葡萄糖氧化酶（GOD）对动物具有以上诸多的有益效果，但酶活性在没有保护剂存在的条件下，pH＞8.0或pH＜3.0时会迅速失活。而单胃动物如体重30kg以上的育肥猪、成年母猪、2月龄以上的肉鸡、肉鸭，产蛋鸡等多种畜禽的胃液pH值均在3以下。其中成年猪胃液pH值大多在1～2，2月龄以上肉禽、蛋鸡肌胃胃液pH值大多在1.5～3，当葡萄糖氧化酶（GOD）通过该段消化道时酶活性会显著降低（30%～100%）甚至完全失活，且不可逆。进而限制了葡萄糖氧化酶（GOD）上述动物养殖中的使用。4葡萄糖氧化酶制剂工艺改进鉴于葡萄糖氧化酶酶学性质的限制，在单胃动物（特别是成年猪、禽）的日常应用受到局限。为了提高葡萄糖氧化酶在上述动物养殖中的使用效果，通过对葡萄糖氧化酶进行肠溶包衣，制作出对动物pH＜3.0胃液完全稳定的肠溶型葡萄糖氧化酶微囊或肠溶固体分散体，以完全保护葡萄糖氧化酶的酶活性。该制剂工艺中通过在葡萄糖氧化酶中添加pH5～5.5的酸碱缓冲体系，为葡萄糖氧化酶在动物肠道中发挥最大效能提供最优pH环境。制剂工艺主要解决了以下三个方面的技术问题：4.1通过在葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase，E.C.1.1.3.4，GOD）中添加pH5～5.5的酸碱缓冲体系，制作出在动物不同肠道中出稳定酸碱环境，可以发挥最大酶催化功效囊芯材料。4.2对葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,E.C.1.1.3.4,GOD）囊芯材料进行肠溶包衣，制成肠溶微囊，完全消除动物胃液低pH环境（pH＜3.0）对葡萄糖氧化酶酶催化活性的影响甚至灭活效应。4.3通过对包衣材料崩解条件的控制和动物不同肠道内环境pH值相适应，制作出在动物十二指肠崩解葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,E.C.1.1.3.4,GOD）微囊，将葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,E.C.1.1.3.4,GOD）酶促氧化效能发挥到最大程度。5技术方案5.1肠溶微囊制剂工艺5.1.1pH5～5.5的酸碱缓冲体系的葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,E.C.1.1.3.4，GOD）囊芯构造5.1.1.1囊芯材料及配比材料：葡萄糖氧化酶，食品级；12水磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O），柠檬酸（C6H8O7）、化学纯；可溶性淀粉，食品级。按工艺要求比例进行芯材材料配比。因均具有吸湿性，需干燥密封保存。5.1.1.2芯材处理工艺要求生产环境相对湿度应控制40%以下，保持通用环境温度（20～25℃）；未包被芯材必须干燥密封保存。（1）缓冲体系预混合缓冲体系磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）：柠檬酸（C6H8O7）按6.8:2的比例在密闭容器内进行充分预混合。（2）芯材预混合将葡萄糖氧化酶：缓冲体系预混合物：可溶性淀粉按100:8.8：12的比例在密闭容器内进行充分预混合。（3）使用干法压片制粒机，对上述芯材进行反复压片筛选制粒，颗粒大小控制在50～2000μm以内。5.1.2芯材颗粒肠溶包衣工艺5.1.2.1肠溶包衣材料及配比肠溶包衣材料包括：虫胶，邻苯二甲酸醋酸纤维素，硬脂酸镁，均为化学纯；聚乙二醇6000；丙酮，无水乙醇，化学纯；按工艺要求，在要求的生产环境中对肠溶包衣材料按配比标准分别称重配比、备用。5.1.2.2肠溶包衣材料预处理先将丙酮、无水乙醇制成混合溶液，并搅拌均匀；顺序加入虫胶2.3份，邻苯二甲酸醋酸纤维素6份，搅拌70-90min，完全溶解后依次加入硬脂酸镁0.2份，聚乙二醇60001.5份，搅拌溶解后备用。5.1.2.3芯材包衣，包衣工艺将待包衣的芯材颗粒置入密封流化床中，通入气流使芯材颗粒流化，将肠溶包衣材料混合溶液输入流化床并雾化，使芯材颗粒表面粘附一层包衣材料，过滤回收系统持续抽走气化的溶液溶剂，并通过冷凝液化系统回收混合溶液以持续使用。如法包衣若干层，至达到规定要求为止。肠溶微囊成品要求：（1）囊芯材料肠溶包衣后增重控制在3.5%以内；（2）肠溶包衣完全，成品肠溶微囊流动性好；（3）肠溶微囊在pH＜2.0盐酸溶液检查2h，不得裂缝崩解或软化，于pH为6.8的磷酸盐缓冲液中1h内应全部崩解；（4）检查肠溶微囊崩解后酶活性不得低于包衣前的95%。5.2葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,E.C.1.1.3.4,GOD）固体分散体构造5.2.1固体分散体材料及配比：5.2.1.1喷涂药物材料准备：葡萄糖氧化酶，、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、虫胶，化学纯；硬脂酸镁、聚乙二醇6000丙酮、无水乙醇，化学纯；5.2.1.2材料配比：虫胶2.4份，邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素6份，硬脂酸镁0.1份，聚乙二醇60001.5份，丙酮50份，无水乙醇60份比例进行材料配比。因均具有吸湿性，需干燥密封保存。5.2.2固体分散体处理工艺固体分散体芯材载体为麦饭石或玉米芯（粒径100～1000um）必须干燥密封保存。5.2.2.1在工艺要求生产环境中将上述材料按配比标准分别称重备用。5.2.2.2固体分散体药物喷涂体系预混合先将丙酮、无水乙醇制成混合溶液，并搅拌均匀；顺序加入虫胶、邻苯二甲酸醋酸纤维素，搅拌70～90min，完全溶解后依次加入硬脂酸镁0.1份，聚乙二醇60001.5份，搅拌溶解后备用。5.2.2.3将葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,E.C.1.1.3.4,GOD）搅拌均匀分散到肠溶分散体系的有机溶剂溶液中5.2.2.4固体分散体喷涂工艺将待喷涂的芯材载体麦饭石或玉米芯颗粒置入密封流化床中，通入气流使载体芯材颗粒流化，将葡萄糖氧化酶（GOD）肠溶有机溶剂混合溶液输入流化床并雾化，使固体载体颗粒表面粘附一层肠溶有机溶剂混合溶液，过滤回收系统持续抽走气化的溶液溶剂（丙酮、无水乙醇），而使颗粒表面不断干燥，并通过冷凝液化系统回收混合溶液以持续使用。如法喷涂若干层，至达到规定要求为止。5.2.2.5葡萄糖氧化酶（GOD）肠溶固体分散体成品制剂要求：（1）载体材料肠溶喷涂包衣后增重控制在20～25%；（2）葡萄糖氧化酶（GOD）肠溶混合溶液喷涂完全，固体分散体成品流动性好；（3）肠溶固体分散体在pH＜2.0盐酸溶液检查2h，不得裂缝崩解或软化，于pH为6.8的磷酸盐缓冲液中1h内应全部崩解溶出。（4）检查固体分散体崩解后酶活性不得低于加工前的95%。6葡萄糖氧化酶肠溶微囊及固体分散体包衣结构示意图（见图1和图2）图1（1葡萄糖氧化酶；2pH缓冲体系；3可溶性淀粉；4囊芯颗粒；5肠溶包衣材料）图2（1葡萄糖氧化酶；2固体分散体载体；3固体分散体肠溶药物表层喷涂物）7葡萄糖氧化酶肠溶制剂工艺达到的效果7.1肠溶微囊和固体分散体借助肠溶包衣的保护，克服动物（猪、禽）胃液（