吉林大学生物基础国家级实验教学示范中心

·1·T淋巴细胞转化试验于彬E-mail：yubin@淋巴细胞在体外培养时，受到刺激物的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。此现象称为淋巴细胞转化现象（简称为淋转）。淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。淋巴细胞转化概念·3·检查患者细胞免疫功能估计疾病的疗效及预后细胞配型抗原的检查：移植免疫免疫药理学：具有免疫调节的药物、保健品、中草药及生物制品卫生毒理学的研究淋巴细胞转化实验的应用·4·实验分组及材料实验原理主要操作步骤检测方法实验主要内容·5·实验分组及材料器材75%酒精 若干无菌纱网 1块/组无菌平皿 1块/组无菌96孔培养板 1块/组细胞计数板 1套/组显微镜 1台/组可调微量加样器 1套/4人无菌吸头（大、中、小）1套/4人EP管 25个/4人眼科剪、小镊子 1饭盒/4人5ml注射器1个/组100ml烧杯1个/组细胞培养箱（37℃5%CO2)酶标仪1台离心机 2个/room超净台 2个/room分组：每组4人

动物及试剂小鼠1只/组培养液(1640)无FCS10ml/组

培养液(1640)10%FCS10ml/组

50ml灭菌离心筒1个/组ConA(200ug/ml)200ul/组MTT（5mg/ml)

0.7ml/组滤纸一块二甲亚砜（DMSO) 3ml/组·6·Lymphocytes(B/T)mitogensSpecificityAgProliferationtransformationlymphoblastNucleic

Acid↑Protein↑T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。原理·7·有丝分裂原（mitogen）来自植物蛋白或细菌产物，它能与多种细胞膜糖类及寡糖基分子结合，后者为丝分裂原受体、结合后能促使细胞活化和诱导细胞分裂。T和B细胞表面都有丝裂原受体，在体外可非特异性刺激静止淋巴细胞向淋巴母细胞转化。这种转化细胞DNA合成增加，出现细胞体积增大，胞浆增多，嗜碱性以及产生有丝分裂等形态变化。有丝分裂原·8·Tcellproliferation植物血凝素（phytohemagglutinin,PHA)(人T）刀豆素A（concanavalin,ConA）（鼠T）美洲商陆（pokeweedmitogen,PWM)B

cellproliferation脂多糖（lipopolysaccharide,LPS)(鼠B）金黄色葡萄球菌A蛋白（staphylococcalproteinA,SPA)（人B）美洲商陆（pokeweedmitogen,PWM)常用的丝裂原·9·形态学观察法3H-TdR（3H-胸腺嘧啶核苷）掺入法MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）本次实验采用MTT法常用的检测方法·10·淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细胞的3~4倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并形成空泡。根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，按下式计算转化率：

形态学检测方法·11·G0G1有丝分裂原特异性抗原SPr,RNA,DNA前体物质DNA↑↑NewDNA3H-TdRTdR3H-TdRcpm3H-TdR掺入法·12·T细胞在PHA或ConA刺激下转化为淋巴母细胞，同时DNA和RNA合成明显增加，此时将同位素3H标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），加入培养液内，则被作为DNA原料摄入到转化的细胞内，测定细胞内掺入DNA中的3H-TdR的放射性相对数量（以脉冲数cpm表示）可用来表示转化率的高低。测定低能量3H的放射性需用液体闪烁计数器。3H-TdR掺入法·13·活/增殖期的细胞线粒体能量代谢琥珀酸脱氢酶MTTMTT掺入还原甲臢颗粒formazan细胞内/周围溶解测OD490值MTT法DMSO·14·MTT法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。MTT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。小鼠脾细胞受到ConA作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，用二甲亚砜(DMSO)溶解所生成的甲臜颗粒，其生成量与细胞数目和/或细胞活性呈正相关，通过检测490nm处光密度值变化，可间接反映细胞生长及增殖活性。MTT法·15·第一天杀鼠取脾捣碎获得细胞计数细胞稀释（1×107）上样（100ul/孔）ConA的梯度稀释上样（100ul/孔）将96孔板置于细胞培养箱，做好标记，5%CO237℃培养48小时第三天取出96孔板加入MTT(5mg/ml)20ul/孔5%CO237℃，继续培养2小时。2000rpm，离心10min。小心弃去上清，加入100ul/孔DMSO振荡，使颗粒全部溶解。酶标仪测吸光度值：OD490nm结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值实验步骤·16·1W无菌取脾研磨成单细胞悬液+1640（无FBS)细胞计数【?/ml】取20ul细胞+980ul的1640混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝加板(三复孔)(加法见附图)调细胞浓度1×107个/ml5%CO237℃培养48小时培养终止前2小时加入MTT(5mg/ml)20ul/孔5%CO237℃继续培养2小时2000rpm10min小心弃去上清，加入100ul/孔DMSO振荡，使颗粒全部溶解酶标仪测吸光度值：OD490nm结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值实验流程·17·单细胞悬液的制备小鼠脱臼处死，75%酒精浸泡消毒2-3分钟。于超净台内取出脾组织，放入预先盛有5ml无血清1640培养液的平皿内。用纱网包裹住脾组织，将脾剪成小块，用5ml注射器塞轻压使脾细胞透过纱网。然后用1000ul加样器隔着纱布将脾细胞悬液吸出，放入50ml无菌离心管中，再分别用1ml培养液冲洗纱网和平皿，并将细胞悬液吸出，放入同一50ml离心管中，剩余3ml培养液备用。2000rpm，常温离心6分钟，弃上清，加3ml含血清1640培养液重悬细胞。细胞计数取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。用含血清1640培养液调细胞浓度至1×107/ml，每组所需总量为4ml（此步可使用之前装无血清培养液的离心管）。详细实验步骤·18·细胞计数板查出四个大方格（16个小方格/大格）的总细胞数(X)；算出每个大方格的细胞数：A=X/4每个大方格的体积为：V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=A×104×稀释倍数(100)4·19·细胞培养按图所示加板。将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃5%CO2培养箱中，培养48小时。MTT掺入：在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。每孔内加入MTT（5mg/ml)20ul，加完后轻轻搕板，使MTT和细胞混匀。在37℃5%CO2培养箱中继续培养2小时，取出板，观察颜色变化，然后离心2000rpm，10min，轻轻吸去上清，注意不要将孔底部的颗粒物吸出）观察板底是否有蓝色的颗粒。加入100ul二甲亚砜（DMSO)，轻轻晃板，将颗粒完全溶解。结果测定：结果测量：用酶标仪测定490nm处光密度值（OD490nm），记录结果。结果判定：SI（刺激指数）=ConA刺激孔值/对照孔值详细实验步骤·20·100µL

ConA200ug/mlConA的倍比稀释400µL含10%血清的1640400µL400µL400µL400µL400µL400µL1234567900µL含血清的1640201052.51.250.6250.3130.157ug/ml0400µL含10%血清的1640·21·12354760111每个样品设置三复孔

100ulspleen

Cell+100ul

ConA20ug/ml100ulspleencell+100ulConA10ug/ml100ulspleenCell+100ulConA5ug/ml100ulspleenCell+100ulConA2.5ug/ml100ulspleenCell+100ulConA1.25ug/ml100ulspleenCell+100ulConA0.625ug/ml100ulspleenCell+100ulConA0.313ug/ml100ulspleen

Cell+100ul10%1640“0”