《铁皮石斛干细胞室内培育生产技术规程（征求意见稿）》

江苏省市场监督管理局发布IICS65.020.20B31DB32—2022TechnicalregulationoftheindoorcultivationofstemcellsfromDendrobiumoficinale 2规范性引用文件 3术语和定义 13.1铁皮石斛干细胞室内培育 4生产条件 5种源干细胞获取、筛选与增殖 15.1培养基配制 15.2种源干细胞获取 15.3种源干细胞筛选纯化 25.4种源干细胞增殖 26培育生产 26.1培养基配制 26.2培育操作 27规模化生产 2 29采收 210质量等级划分 311包装、运输、储存 311.1包装 311.2运输 311.3贮存 3本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由江苏省农业科学院提出。本文件由江苏省园艺标准化委员会归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院，苏州普朗特尔皮肤细胞科技有限公司，西交利物浦大学，苏州珀立科技服务有限公司，思格（苏州）生物科技有限公司，苏州工业园区服务外包职业学院。本标准起草人：陈小龙、张杰、吴红升、余向阳、宋立晓、周燕群、王牧、任宝永、李毅、覃鸿妮。铁皮石斛干细胞室内培育生产技术规程本标准规定了铁皮石斛干细胞室内培育的术语和定义、生产条件、种源干细胞获取、筛选与增殖、培育生产、规模化生产、日常管理、采收、质量等级划分、包装、运输及贮存。本标准适用于铁皮石斛干细胞室内培育生产。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期引用文件，仅所注日期版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用于本文件。GB5749生活饮用水卫生标准GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1铁皮石斛干细胞室内培育（TheindoorcultivationofstemcellsofDendrobiumofficinale）从铁皮石斛茎尖部分离体培养植物愈伤组织，经稳定培育，得到铁皮石斛植物干细胞，再通过进一步扩增培育成的稳定迅速增殖铁皮石斛干细胞培育技术。4生产条件室内环境为十万级以上洁净度的洁净间。保持室温25oC~28oC。均匀柔和人工光，光照强度为2000Lux，种源培育与增殖阶段为完全黑暗，种源生产阶段光暗周期8h：16h。空气相对湿度40%~70%。生产用水和过滤水应分别符合GB5749和GB/T6682的规定。5种源干细胞获取、筛选与增殖5.1培养基配制采用1/2MS培养基+2mg/LNAA+0.5mg/L6-BA+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂固体培养基进行种源干细胞诱导固体培养。采用1/2MS培养基+1mg/L6-BA+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂固体培养基进行种源干细胞增殖固体培养。5.2种源干细胞获取将成熟铁皮石斛茎尖组织从茎段上分离后，切成细小的组织块，加入固体培养基中培养，在完全黑暗条件下培养2周~4周，获得愈伤组织细胞。在相同固体培养基和培养条件下增殖愈伤组织细胞。5.3种源干细胞筛选纯化愈伤组织细胞增殖后，每10d将死亡的、褐化和玻璃化的愈伤组织清理出培养体系，筛选留存淡黄色或浅绿色、生长茁壮、均一的种源干细胞进一步培育。5.4种源干细胞增殖按照鲜重0.2g~0.3g/cm2接种量，将种源干细胞转接至500mL玻璃瓶中进行固体培养。培养过程中，每21~28天更换新培养基，培养周期为50d~55d。6培育生产6.1培养基配制采用1/2MS培养基+1mg/L6-BA+20g/L蔗糖+7.5g/L琼脂固体培养基+10g/L马铃薯提取物进行种源干细胞培育生产。6.2培育操作按0.4g/L~0.5g/L接种量，将种源干细胞转接至1L玻璃瓶中。在培养过程中，每20~25天更换新培养基，培养周期为50d~55d。待干细胞生长总重量至加入重量的10倍时，采收或留做干细胞增殖的种源细胞。7规模化生产按0.4g/L~0.5g/L接种量，将采收的种源干细胞转接至2L~3L的固体培养瓶中，如发现褐化、玻璃化组织，及时清除出培养体系。其它按本标准第6章的规定执行。一旦发现细菌或真菌的污染，立即将污染品移出培育生产间并进行湿热高温灭菌。9采收采收时剔除褐化的干细胞团，选取颜色，生长状态和生长速率稳定的干细胞组织，作为铁皮石斛种源干细胞，用于后续的诱导和育苗。10质量等级划分铁皮石斛干细胞质量等级划分要求见表1。表1铁皮石斛干细胞质量等级划分要求等级要求特级形态规则，干细胞成团性好，直径大于8mm，干细胞颗粒均匀，淡黄色或淡绿一级形态基本规则，干细胞成团性较好，直径3mm~6mm，干细胞偶见黄褐色斑点，淡黄色或淡绿色。二级形态差别较大，直径2mm~8mm，干细胞团中混有褐色部分，淡黄色或淡绿色。11包装、运输、储存11.1包装分