羊副流感3型诊断技术规范

1羊副流感3型诊断技术规范本文件规定了绵羊、山羊副流感3型的临床症状、病原分离、RT-PCR、ELISA方法的实验室诊断技术要求。本文件适用羊饲养场（户）和动物疫病诊疗单位对羊副流感3型病毒的检测。2规范性引用文件下列文件中内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法3术语与定义下列术语与定义适用于本文件。3.1羊副流感病毒3型CaprineParainfluenzavirustype3，CPIV3属于副黏病毒科，呼吸道病毒属成员，为有囊膜的单股负链RNA病毒。该病毒可引起以羊发热、呼吸困难、流浆液性或黏脓性鼻液和咳嗽等呼吸道症状为特征的疾病。4缩略语下列缩略语适用于本文件。RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）TAE缓冲液：是由三羟甲基氨基甲烷(TrisBase)、乙酸(AceticAcid)和乙二胺四乙酸(EDTA)组成的缓冲液FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferSolution）5临床症状病羊主要临床症状包括：流清亮或黏脓性鼻液、咳嗽气喘、体温升高到40℃以上、精神沉郁、食欲减退、部分羊可见流泪、结膜炎、流涎、有时出现腹泻。6实验室诊断26.1病毒分离方法6.1.1材料棉签、FBS、DMEM培养基、青霉素、链霉素、细胞培养瓶（板）。6.1.2仪器电子天平、研磨仪、低温高速离心机、生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、冰箱。6.1.3细胞牛肾细胞（MDBK）。6.1.4病料采集6.1.4.1呼吸道拭子用无菌棉签采取鼻道分泌物，然后放入含1000IU/ml青霉素1000µg/ml链霉素的DMEM培养基的冻存管中，编号，记录，2℃~8℃条件下，尽快送往实验室。6.1.4.2粪便拭子用无菌棉签插入肛门取样或用棉签采集新鲜粪便，然后放入含1000IU/ml青霉素1000µg/ml链霉素的DMEM培养基中，编号，记录，2℃~8℃条件下尽快送往实验室。6.1.4.3血清样品用促凝管采集新鲜血液，静置分离血清，编号，记录，2℃~8℃条件下尽快送往实验室。6.1.4.4组织样品刚死亡的羊，采集肺组织样品，放入离心管，编号，记录，2℃~8℃条件下尽快送往实验室。6.1.5样品处理6.1.5.1先经冻融两次，拧干棉拭子，将样品液经6000r/min离心10min，使用一次性注射器吸取上清经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃以下保存备用。6.1.5.2血清将促凝管中静置分层的血清转移到灭菌离心管，-20℃以下保存备用。6.1.5.3组织按体积比1:3～1:5加入PBS（pH7.2～7.4），使用组织研磨仪制成匀浆液，取悬液经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃以下保存备用。6.1.6样品接种取处理过的样品200μl（样品接种量根据细胞数目调整）接种到长满80%的MDBK细胞（25㎝2培养瓶），37℃吸附30min；加入含2%FBS的细胞培养液5ml，同时设对照组，置于37℃,5%CO2的培养箱。6.1.7结果判定逐日观察细胞病变，培养5日后冻融两次，继续盲传，观察细胞病变。CPIV3致细胞病变特点：细胞变圆、大量脱落、贴壁细胞变长聚集形成网状。盲传三代后，若出现病变则收获培养物，经反复冻融，以3000r/min离心10min，去除细胞碎片并取上清液进一步鉴定。6.2RT-PCR6.2.1材料3移液器及吸头、无菌无酶离心管、PCR管、病毒RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒、TAE缓冲液、琼脂糖、核酸染料、引物（附录A）6.2.2仪器PCR仪、台式冷冻离心机、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪。6.2.3待检样品处理后的样品或细胞培养物。6.2.4病毒RNA提取使用病毒RNA提取试剂盒对已处理的待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品进行RNA提取并使用核酸分析仪对RNA质量及浓度进行测定。6.2.5RT-PCR反应体系6.2.5.1RT反应65℃保温5min后，冰上迅速冷却。在上述Microtube管加5×PrimeScriptIIBuffer4μl，RNase4.5μl，缓慢混匀。反应条件42℃45min，95℃5min后，冰上冷却。6.2.5.2PCR反应25μl体系：Premix溶液12.5µl，上下游引物（见附录A）各0.5µl，cDNA模板2µl，无菌无酶水9.5µl。反应条件为：95℃预变性5min,95℃30s，50℃30s，72℃60s，进行35个循环，72℃延伸10min。6.2.6结果判定取PCR产物10µl，在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电压100V，时间30min，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察结果。当阳性对照样品出现400bp扩增带、阴性对照样品无扩增带出现时，试验结果成立。被检样品出现400bp扩增带为羊副流感病毒阳性，否则为阴性。6.3间接ELISA抗体检测6.3.1材料CPIV3重组N蛋白、阴性血清对照、阳性血清对照、辣根过氧化物酶标记的驴抗羊二抗、抗原包被缓冲液（见附录B.1）、洗涤液（见附录B.2）、封闭液（见附录B.3）、TMB底物显色试剂盒和终止液（见附录B.4）。6.3.2仪器设备酶标板、酶标仪、移液器及吸头。6.3.3操作方法6.3.3.1抗原包被4将CPIV3重组N蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为0.05μg/mL，每孔100μL包被96孔酶标板，4℃包被16h。用洗涤缓冲液洗板5次，每孔200µl，每次3min，洗涤结束后拍干。200µl/孔加入封闭缓冲液，37℃封闭1.5h，用洗涤缓冲液洗板5次后拍干。6.3.3.2洗板甩掉孔内的包被液，洗涤液（200µl/孔），洗涤三次。6.3.3.3封闭每孔加封闭液（200µl/孔），置37℃封闭1h,洗涤三次。6.3.3.4加样酶标板上对照和样品的分布图，见图1。在A1孔和B1孔加入CPIV3阳性对照血清各100μl，在C1孔和D1孔加入CPIV3阴性对照血清各100μl；剩余孔加入待检样品血清100μl，每孔两个平行，37℃孵育0.5h，洗板同上。123456789APBPCNDNEFGH图1样品加样记录表（推荐模式）说明：P—阳性血清对照孔；N—阴性血清对照孔；S1、S2、S3、S4等—待检血清孔，以此类推。6.3.3.5加酶标记抗体每孔加入用封闭液稀释至工作浓度的酶标记抗体100µl，置37℃再孵育1h，洗涤三次。6.3.3.6加底物溶液加入显色底物(TMB)溶液100µl/孔，置37℃避光反应15min。6.3.3.7终止反应加入终止液50µl/孔,混匀后即刻测量OD450值。6.3.4结果判定6.3.4.1P/N比法被检样品(P)的吸光度值和阴性标准样品(N)值之比。52.0>P/N>1.50P/N>2.06.3.4.2目视比色法判为阴性判为可疑判为阳性被检血清孔近于或浅于标准阴性血清孔者判为阴性；略深于标准阴性血清孔者判为可疑；明显深于标准阴性血清孔者判为阳性。7综合判定7.1经5判定为疑似CPIV3感染病例，经病毒分离培养和PCR方法检测出CPIV3，可判为羊副流感3型病毒感染。7.2临床无明显特异症状的非免疫动物经间接ELISA方法检测出抗体阳性，可判为该动物曾感染或已感染羊副流感3型病毒，需结合其他方法进行综合确诊。6（资料性）A.1引物序列产物大小上游引物CATTGAATTCATACTCAGCAC400bp下游引物AGATTGTCGCATTT(AG)CCTCA.2引物溶解上下游引物用无菌的DEPC处理水配制成10µmol/l。（资料性）试剂的配制B.1抗原包被缓冲液（0.05mol/lpH9.6碳酸盐缓冲液）碳酸钠碳酸氢钠去离子水0.318g0