TCRHA 059-2024 基质辅助激光解吸电离飞行时间核酸质谱法体细胞突变检测通则

ICS11.040.01CCSN54团 体 标 准T/CRHA059—2024基质辅助激光解吸电离飞行时间核酸质谱法体细胞突变检测通则Generalrulesformatrix-assistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometryfordetectingsomaticmutations2024-07-05发布 2024-07-10实施中国研究型医院学会 发布T/CRHA059—2024目 次前言 III范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1缩略语 1原理 2试剂与耗材 2仪器与设备 2操作步骤 3样本的预处理 3核酸提取及要求 3PCR反应 3SAP消化反应 3单碱基延伸反应 3核酸质谱法分析 3性能分析 3准确度 3检测限 3特异性 3质量控制 4样品质量控制 4设备质量控制 4软件质量控制 4过程质量控制 4记录质量控制 4室间质量评价 4结果分析 4质谱图分析 4软件分析 5结果表述 5检测报告 5检测结果的描述 5实验室要求 5实验室资质 5人员资质和培训 5IT/CRHA059—2024附录A（资料性） PCR反应液配方表及反应程序 6附录B（资料性） SAP反应混合液配方表及反应程序 7附录C（资料性） 单碱基延伸反应混合液配方表及反应程序 8参考文献 9IIT/CRHA059—2024前 言本文件按照GB/T1.1—20201草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国研究型医院学会临床数据与样本资源库专业委员会提出。本文件由中国研究型医院学会归口。本文件起草单位：中国人民解放军总医院、浙江迪谱诊断技术有限公司、北京大学肿瘤医院、火箭军特色医学中心、迪安诊断技术集团股份有限公司、济南市中心医院。IIIT/CRHA059—2024基质辅助激光解吸电离飞行时间核酸质谱法体细胞突变检测通则范围本文件适用于样本类型包括但不限于新鲜肿瘤组织、肿瘤组织石蜡包埋或者细胞石蜡包埋的切片。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T6041-2020质谱分析方法通则GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GB19489-2008实验室生物安全通用要求T/ZZB2482—2021飞行时间核酸质谱仪术语和定义下列术语和定义适用于本文件。引物primer结合于模板链上，引导聚合酶进行延伸的起始位点或终止位点的，具有一定长度和顺序的寡核苷酸。聚合酶链式反应polymerasechainreaction一种在体外对模板DNA或RNA的特定片段进行快速扩增的方法包含变性----退火 延伸三个基本反应步骤。单碱基延伸singlebaseextension适宜的反应体系中，在延伸引物引导下，聚合酶以ddNTP或者acyNTP为底物仅延伸单个碱基。注：常用于DNA测序和SNP检测。体细胞突变somaticmutation相对于胚系突变而言的，发生在体细胞中的突变，即在体细胞发生了基因突变或染色体畸变，突变性状一般不能传给下一代个体，却可以引起当代某些细胞的遗传结构发生改变的突变。注：本文件的体细胞突变指单碱基突变。缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）1T/CRHA059—2024SAP：虾碱性磷酸酶（shrimpalkalinephosphatase）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）dUTP：脱氧尿苷三磷酸（2'-deoxyuridine5'-triphosphate）ddATP：2',3'–二脱氧腺苷5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-adenosine-5'-triphosphate）ddGTP：2',3'-二脱氧鸟苷5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-guanosine-5'-triphosphate）ddCTP：2',3'-二脱氧胞苷5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-cytidine-5'-triphosphate）ddTTP：2',3'-二脱氧胸苷5'-三磷酸（2',3'-Dideoxy-thymidine-5'-triphosphate）UDG：尿嘧啶DNA糖基酶（Uracil-DNAGlycosylase）原理待检测样本中提取纯化获得DNAPCRSAP消化去除扩增产物中多余的dNTP，加入序列特异性延伸引物（其3’端碱基紧挨突变位点）和突变位点特异性DNA样品中含量低至1%的突变。试剂与耗材除另有规定，所用试剂均为分析纯。本方法中的纯化水应符合GB/T6682—2008的二级水。也可根据自身实验需求，选择其他型号的同等功能的耗材和试剂。以20µL体系为例，推荐试剂与耗材如下：10xPCR缓冲液；50mmol/L氯化镁溶液；25mmol/LdNTP/dUTPMix；5U/µLDNA聚合酶；1U/µLUDG；纯化水；10×SAP缓冲液；1.7U/µLSAP酶；10x延伸缓冲液；ddATPMix；ddGTPMix；ddCTPMix；ddTTPMix；单碱基延伸引物；延伸酶；质谱芯片。仪器与设备包含但不限于以下设备：超净工作台；纯水仪；涡旋震荡仪；高速离心机；掌式离心机；板式离心机；生物安全柜；2T/CRHA059—2024紫外可见分光光度计；PCR扩增仪；飞行时间核酸质谱仪。操作步骤样本的预处理新鲜组织样本，根据组织大小剪碎、用玻璃匀浆器将组织彻底研磨。蜡块样本，需切成5片4μm厚度的连续切片，其中1片进行HE染色，确保含有肿瘤病变细胞比例不低于20%，用于核酸提取的需有3张～5张连续性的切片。核酸提取及要求使用核酸提取试剂盒提取或同类方法；提取的核酸纯度通过A260/A280比率判定，DNA的A260/A280的比值建议在1.8～2.0之间。PCR反应PCR反应试剂配制、PCR反应程序参见附录A。SAP消化反应SAP消化反应步骤如下：BSAP2μL；PCR8.3的扩增产物，放入掌式离心机，5000rpm30s；PCRSAP5μL7μL30s，放入掌式离心机，5000rpm30s；PCRBSAP程序进行消化反应。单碱基延伸反应单碱基延伸反应步骤如下：C配制单碱基延伸反应混合液；PCR8.4SAP产物，放入掌式离心机，5000rpm30s；2μLPCR/SAP30s，放入掌式离心机，5000rpm30s；PCRC的延伸反应程序进行延伸反应。核酸质谱法分析飞行时间质谱仪应符合T/ZZB2482—2021的要求。按照飞行时间核酸质谱仪的操作说明将8.5的延伸产物进行检测和分析。性能分析准确度选取10（包含弱阳性样本检测限经数字PCR5次或进行205次重复检测，应100%检出；如果是2019次。特异性3T/CRHA059—2024检测试剂盒检测范围外的其他突变位点的国家参考品或经标化的企业参考品，检测结果应为阴性；检测野生型国家参考品或其他物种的基因组样本，检测结果应为阴性或未检出突变。质量控制样品质量控制2针～4保存送检；手术新鲜组织需半个米粒大小，置于组织保存液中，4℃～8℃保存送检。石蜡/3µm～5µm1cm×1cm10张，肿瘤含20%，蜡卷数量要求同白片。白片需经防脱处理，装入切1.5ml离心管中密封常温保存送检。A260/2801.6～2.0100bp。保存于-80℃冰箱。设备质量控制根据实验室要求选择符合要求的设备，设备应定期校准和维护，并按照对顶的使用方法使用。软件质量控制过程质量控制DNA。空白对照一般使用纯化水。质控规则：实验室应建立适用的质控规则用来监控和分析失控原因。阳性质控品检出结果应于靶值相同，阴性质控品、空白对照检出应符合预期，每次质控结果做好质控记录。记录质量控制室间质量评价结果分析结果分析应符合GB/T6041-2020的要求。其中：质谱图分析将对应检测点不同位置的若干质谱图合成该检测点的单一质谱图；通过基于小波的数字滤波器来消除高频噪声和基线；基于质谱图的拟合曲线，获得峰高、峰宽、峰面积，质量偏移以及信噪比。4T/CRHA059—2024软件分析分析软件应能够分析每个样本对应位点质谱峰的峰高、峰面积和信噪比等信息。利用质谱分析软件，分析阳性对照、阴性对照的检出情况，阳性对照和阴性对照应满足预期要求。分析内参的信号峰和突变位点的信号峰，对每个样本的突变位点进行判断，按照具体试剂盒阴阳性判断值的要求进行结果判读，符合试剂盒阴性要求的判断为无突变或低于试剂盒检测要求，符合试剂盒阳性要求的判断为突变型。结果表述检测报告样本检测报告包含但不限于以下内容：样本信息：样本来源信息、样本唯一性标识、样本类型、样本状态、采样日期、送检日期、以及用于判断结果所必须的其他信息等；检测信息：检测方法、检测项目、检测范围、必要的检测性能指标、实验室名称、实验室联系方式、检测人员、审核人员、检测结果对应的解释或数据资料、样本接收日期、报告日期等；样本检测及结果审核发布：检测人员需通过岗位考核并具有初级检验技师/士职称，授权签字人进行结果审核及发布；技术局限性：核酸质谱法对体细胞突变检测是已知位点的定性测试，在定量检测方面有一定的技术局限性。检测结果的描述对于肿瘤体细胞突变，基因变异宜按以下分析方式处理。在位点设计阶段应考虑已写入中外诊疗指南或有明确专家共识的变异位点。对于检测结果应注明变异位点的来源，明确其药物及其临床意义。并根据证据等级分级。处于争议或临床意义不明确的基因变异，实验室应制定统一的标准来应对出现的不明变异。实验室要求实验室资质实验室设计应符合实验流程，便于操作和使用。实验室设备应符合相关标准和规定，确保准确性和安全性。。实验室环境应具备适宜的温湿度控制和照明条件，应具备相应的防护设施，同时应设置相应的环保设施。GB19489-2008的要求。设置安全出口和消防设施，配备相应的安全设备，同时制定安全管理制度，规范实验操作流程，确保实验室和人员的安全。实验室废弃物应分类收集、分类处理，产生的有害废弃物应按照规定进行无害化处理，确保环境安全。a) 人员资质和培训PCR5T/CRHA059—2024附录A（资料性）PCR反应液配方表及反应程序PCR反应液配方表见表A.1，PCR反应程序见表A.2。表A.1PCR反应液配方表试剂名称浓度用量/µLPCR缓冲液10×2.0氯化镁溶液50mmol/L1.6dNTP/dUTPmix25mmol/L0.1DNA聚合酶5U/µL0.2UDG1U/µL0.2F/R引物10µmol/L0.6纯化水/13.4DNA≥5ng/µL2.0总量/20.0表A.2PCR反应程序步骤温度/℃时间循环数1372min129510min139520s556530s44∞1注：PCR产物暂时不进行下一步实验操作，可4℃保存不超过12h。6T/CRHA059—2024附录B（资料性）SAP反应混合液配方表及反应程序SAP反应混合液配方表见表B.1，SAP反应程序见表B.2。表B.1SAP反应混合液配方表试剂名称浓度用量/µL10xSAP缓冲液10×0.17SAP1.7U/µL0.3水/1.53总量/2.0表B.2SAP反应程序步骤温度/℃时间循环数13740min12855min134∞1注：建议SAP反应产物及时进行下一步实验操作，若暂不进行下一步操作，可2℃～8℃保存不超过24h。7T/CRHA059—2024附录C（资料性）单碱基延伸反应混合液配方表及反应程序单碱基延伸反应混合液配方表见表C.1，单碱基延伸反应程序见表C.2。表C.1单碱基延伸反应混合液配方表试剂名称浓度用量/µL10x延伸缓冲液10×0.2ddATPmix/ddGTPmix/ddCTPmix/ddTTPmix/0.2单碱基延伸引物5µmol/L～15µmol/L0.94延伸酶32U/µL0.04纯化水/0.62总量/2.0表C.2单碱基延伸反应程序步骤温度/℃时间循环数19530s12955s14