牛副流感病毒3型诊断技术规范

1牛副流感3型诊断技术规范本文件规定了牛副流感3型的临床症状、病原分离鉴定、RT-PCR、ELISA等实验室诊断技术要求。本文件适用于奶牛饲养场（户）、肉牛饲养场（户）和动物疫病诊疗单位对牛副流感病毒3型的检测。2规范性引用文件下列文件中内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1牛副流感病毒3型Bovineparainfluenzavirustype3,BPIV3牛副流感病毒3型，属于副黏病毒科，呼吸道病毒属成员，为有囊膜的单股负链RNA病毒。该病毒可引起牛以发热、呼吸困难、流浆液性或黏脓性鼻液和咳嗽等呼吸道症状为特征的疾病。4缩略语下列缩略语适用于本文件。RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）TAE缓冲液：是由三羟甲基氨基甲烷(Trisbase)、乙酸(aceticacid)和乙二胺四乙酸(EDTA)组成的缓冲液FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersolution）5流行病学牛副流感3型一年四季均发，以秋冬、初春季多见。各种年龄牛均可感染。6临床症状2病牛以高热、呼吸困难和咳嗽为临床特征。7实验室诊断7.1病毒分离方法7.1.1材料棉签、胎牛血清（FBS）或新生牛血清（NBS）、DMEM培养基、青霉素、链霉素、细胞培养瓶（板）。7.1.2仪器电子天平、研磨仪、低温高速离心机、生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、细胞培养瓶、冰箱。7.1.3细胞牛肾细胞（MDBK）和非洲绿猴肾细胞（Vero）。7.1.4病料采集7.1.4.1呼吸道拭子用无菌棉签采取鼻道分泌物，然后放入含1000IU/ml青霉素和1000µg/ml链霉素的DMEM培养基的冻存管中，编号，记录，2℃~8℃条件下尽快送往实验室。7.1.4.2血清样品用促凝管采集新鲜血液，静置分离血清，编号，记录，2℃~8℃条件下尽快送往实验室。7.1.4.3组织样品刚死亡的牛，采集肺组织样品，放入离心管，编号，记录，2℃~8℃条件下尽快送往实验室。7.1.5样品处理7.1.5.1拭子先经冻融两次，拧干棉拭子，将样品液经6000r/min离心10min，使用一次性注射器吸取上清经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃以下保存备用。7.1.5.2血清将促凝管中静置分层的血清转移到灭菌离心管，-20℃以下保存备用。7.1.5.3组织按照体积比为1:3～1:5加入PBS（pH7.2～7.4使用组织研磨仪制成匀浆液，取悬液经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃下保存备用。7.1.6样品接种取处理过的样品200μl（样品接种量根据细胞数目调整）接种到长满80%的MDBK细胞（25cm2培养瓶），37℃吸附30min；加入含2%FBS或NBS的细胞培养液5ml，同时设对照组，置于37℃,5%CO2的培养箱。37.1.7结果判定逐日观察细胞病变，培养5日后冻融两次，继续盲传，观察细胞病变。BPIV3致细胞病变特点：细胞大量脱落、贴壁细胞变长聚集形成网状。盲传三代后，若出现病变则收获培养物，经反复冻融，以3000r/min离心10min，取上清传代扩繁病毒并进一步鉴定。7.2RT-PCR7.2.1材料移液器及吸头、无菌无酶离心管、PCR管、病毒RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒、TAE缓冲液、琼脂糖、核酸染料、引物（见附录A）7.2.2仪器PCR仪、台式冷冻离心机、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪。7.2.3待检样品处理的样品或细胞培养物。7.2.4病毒RNA提取用病毒RNA提取试剂盒对已处理的待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品进行RNA提取，并使用核酸分析仪对RNA质量及含量进行测定。7.2.5RT-PCR反应体系7.2.5.1RT反应65℃保温5min后，冰上迅速冷却。在上述Microtube管加5×PrimeScriptIIBuffer4μl，RNase4.5μl，缓慢混匀。反应条件42℃45min，95℃5min后，冰上冷却。7.2.5.2PCR反应25μl体系：Premix溶液12.5µl，上下游引物（见附录A)各0.5µl，cDNA模板2µl，无菌无酶水9.5µl。反应条件为：95℃预变性5min,95℃30s，50℃30s，72℃60s，进行35个循环，72℃延伸10min。7.2.6结果判定取PCR产物10µl，在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，电压100V，时间30min，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察结果。当阳性对照样品出现400bp扩增带、阴性对照样品无扩增带出现时，试验结果成立。被检样品出现400bp扩增带为牛副流感病毒阳性，否则为阴性。7.3酶联免疫吸附试验7.3.1材料4牛副流感病毒3型重组N蛋白、阴性血清对照、阳性血清对照、辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG、抗原包被缓冲液（见附录B.1）、洗涤液（见附录B.2）、封闭液（见附录B.3）、TMB底物显色试剂盒和终止液（见附录B.4）。7.3.2仪器设备酶标板，酶标仪，移液器及吸头。7.3.3操作方法7.3.3.1抗原包被BPIV3重组N蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为0.05μg/ml包被反应板，每孔100μl，4℃包被16h。7.3.3.2洗板甩掉孔内的包被液，洗涤液洗涤三次，200µl/孔。7.3.3.3封闭每孔加封闭液，200µl/孔，置37℃封闭1h,洗涤三次。7.3.3.4加样标准阴、阳性血清和被检血清均用封闭液作100倍稀释，每份被检血清加2孔，每孔100μl，每块板均设标准阴、阳性血清及稀释液对照各2孔。加样完毕后封板，放37℃孵育1h，洗涤三次。7.3.3.5加酶标抗体每孔加入用封闭液稀释至工作浓度的酶标记抗体100µl，置37℃再孵育1h，洗涤三次。7.3.3.6加底物溶液加入显色底物(TMB)溶液100µl/孔，置37℃避光反应15min。7.3.3.7终止反应加入终止液50µl/孔,混匀后即刻测量OD450值。7.3.4结果判定7.3.4.1P/N比法被检样品(P)的吸光度值和阴性标准样品(N)值之比。2.0>P/N>1.50P/N>2.07.3.4.2目视比色法判为阴性判为可疑判为阳性被检血清孔近于或浅于标准阴性血清孔者判为阴性；略深于标准阴性血清孔者判为可疑；明显深于标准阴性血清孔者判为阳性。8综合判定58.1经6判定为疑似BPIV3感染病例，经病毒分离培养和PCR方法检测出BPIV3，可判为牛副流感3型病毒感染。8.2临床无明显特异症状的非免疫动物经间接ELISA方法检测出抗体阳性，可判为该动物曾感染或已感染牛副流感3型病毒，需结合其他方法进行综合确诊。6（资料性）A.1引物序列产物大小上游引物CATTGAATTCATACTCAGCAC400bp下游引物AGATTGTCGCATTT(AG)CCTCA.2引物溶解上下游引物用无菌的DEPC处理水配制成10µmol/L。（资料性）试剂的配制B.1抗原包被缓冲液（0.05mol/lpH9.6碳酸盐缓冲液）碳酸钠碳酸氢钠去离子水0.318g0.588g200ml