第十章-青霉素的生产

第十章青霉素的生产第一节概述第二节生产原理第三节青霉素的生产工艺过程第四节其他工艺技术及技术改造方向化学工业出版社学习目标了解青霉素的药效作用、应用范围、其它有关工艺技术及技术改造方向；熟悉青霉素的理化性质、重要化学反应；掌握青霉素生产原理、生产工艺过程及生产控制要点。第一节

概述认识青霉素青霉素是一族抗生素的总称，它们是由不同的菌种或不同的培养条件所得的同一类化学物质，其共同化学结构如下：

青霉素本身是一种游离酸，能与碱金属或碱土金属及有机氨类结合成盐类。青霉素游离酸易溶液于醇类、酮类、醚类和酯类，但在水溶液中溶解度很小；青霉素钾、钠盐则易溶于水和甲醇、微溶于乙醇、丙醇、丙酮、乙醚、氯仿，在醋酸丁酯或戊酯中难溶或不溶。青霉素的吸湿性与内在质量有关。纯度越高，吸湿性越小，也就易于存放。因此制成晶体就比无定形粉末吸湿性小。青霉素是一种不稳定的化合物，在水溶液里很快地分解或异构化，因此青霉素应尽量缩短在水中存放时间，特别由于温度、酸、碱性的影响，成为晶体状态的青霉素还是比较稳定的。青霉素对大多数革兰氏阳性细菌，部分革兰氏阴性细菌，各种螺旋体及部分放线菌有较强抗菌作用。青霉素的毒性低微，但最易引起过敏反应。凡应用青霉素药物都必须先作皮试，皮试阳性者禁用。第二节生产原理

青霉素是产黄青霉菌株在一定的培养条件下发酵产生的。生产上一般是将孢子悬液接入种子罐经二级扩大培养后，移入发酵罐进行发酵，所制得的含有一定浓度青霉素的发酵液经适当的预处理，再经提炼、精制、成品分包装等工序最终制得合乎药典要求的成品。青霉素产生菌的培养菌体的生长发育①分生孢子的Ⅰ期；②菌丝繁殖，原生质嗜碱性很强，有类脂肪小颗粒产生为Ⅱ期；③原生质嗜碱性仍很强，形成脂肪粒，积累贮藏物为Ⅲ期；④原生质嗜碱性很弱，脂肪粒减少，形成中、小空泡为Ⅳ期；⑤脂肪粒消失，形成大空泡为Ⅴ期；⑥细胞内看不到颗粒，并有个别自溶细胞出现为Ⅵ期。其中Ⅰ～Ⅳ期称为菌丝生长期，菌丝的浓度增加很多，但产生的青霉素较少，处于该时期的菌丝体适用于做发酵种子。Ⅳ～Ⅴ期是青霉素分泌期，此时菌丝体生长缓慢，并大量生产青霉素。Ⅵ期是菌丝体自溶期。菌种的培养

利用菌体进行发酵生产青霉素的关键是要筛选高产菌种，另外要通过不断地分离纯化来保证高产菌种的纯度，避免生产波动。高产菌种选育和培养还要采用严格的无菌操作，防止污染杂菌。供日常生产的高产纯种还必须用良好的方法妥善保藏，以维持其优良性能，保证生产稳定。种子培养阶段以产生丰富的孢子（斜面和米孢子培养）或大量健状菌丝体（种子罐培养）为主要目的。在培养基中应加入比较丰富易代谢的碳源（如葡萄糖或蔗糖）、氮源（如玉米浆）、缓冲pH的碳酸钙以及生长所必需的无机盐，并保持最适生长温度25～26℃和充分的通气搅拌，使菌体量倍增达到对数生长期。青霉素的生物合成

产黄青霉菌在发酵过程中首先合成其前体，即α-氨基己二酸、半胱氨酸、缬氨酸，再在三肽合成酶的催化下，L-α-氨基己二酸（α-AAA）与L-半胱氨酸形成二肽，然后再与L-缬氨酸形成三肽化合物，三肽化合物在环化酶的作用下闭环形成异青霉素N，异青霉素N中的α-AAA侧链可以在酰基转移酶作用下转换成其它侧链，形成青霉素类抗生素。如果在发酵液中加入苯乙酸，就形成青霉素G。产黄青霉生产青霉素中受下列方式调控：受碳源调控、受氮源、受终产物调控、受分支途径调控。发酵发酵的基本原理青霉素发酵属于好氧发酵过程，需不断通入无菌空气并搅拌，以维持一定的罐压和溶氧。整个发酵阶段分为生长和产物合成两个阶段。发酵过程中应严格控制发酵温度、发酵液中残糖量、pH值、排气中的CO2和氧气量等。一般残糖量可通过控制氮源的补加量来控制；pH值可通过控制补加的葡萄糖量、酸或碱量来调节；通过控制搅拌转速、通气量来调节供氧量及液相中的氧含量；至于发酵温度一般可通过调整冷却介质量来加以调节。还要加入消泡剂（如豆油、玉米油或环氧乙烯聚醚类）以控制泡沫。在发酵期间为检测生产是否染菌，每隔一定时间应取样进行分析、镜检及无菌试验，检测生产状况，分析或控制相关参数。发酵过程经济指标发酵单位即抗生素在发酵液中的浓度，一般用u/ml或μg/ml表示。u为抗菌活性单位，又称效价。青霉素效价单位：为能在50ml肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育的最小青霉素剂量。发酵总亿单位发酵单位与发酵液体积的乘积称为发酵总亿单位，以亿单位（108u）或十亿单位（109u或Bu）表示。发酵总亿单位代表批发酵产量。发酵指数发酵指数是每小时、每立方米发酵罐容积发酵产生的抗生素量。一般以108u/(m3·h)表示，能反映固定成本的效益，即发酵指数越高，固定成本效益也越高。基质转化率发酵过程消耗的主要基质（一般为碳源、能源或其它成本较高的基质）转化为抗生素的得率，称为基质转化率，以g（抗生素）/g（基质）或Bu/kg（基质）表示。发酵液预处理和过滤

青霉素发酵液中杂质很多，其中对青霉素提纯影响最大的是高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）和蛋白质。用离子交换法提纯时，高价无机离子和蛋白质的存在，会影响树脂对抗生素的吸附量。用溶剂萃取时，蛋白质的存在会产生乳化，使溶剂相和水相分层困难。因此，应根据所采用的提纯方法进行预处理除去无机离子或蛋白质。经过预处理的发酵液便可进行过滤去除菌丝体及沉淀的蛋白质。青霉素发酵液过滤宜采用鼓式真空过滤机。青霉素的提取

青霉素发酵液经过预处理和过滤后得到的滤液，滤液中含有不到4%的青霉素及一些与水亲和的杂质存在，因此需经提取和精制加以去除。提取要达到提纯和浓缩两个目的。生产上采用的方法主要有：吸附法、溶媒萃取法、离子交换法和沉淀法。究竟采用哪一种方法，要视产品的性质。青霉素的提取一般采用溶媒萃取法。这种方法主要基于青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉盐易溶于水的特性，反复转移而达到提纯和浓缩。采用溶媒时要考虑对青霉素有较高的分配系数，另外在水中的溶解度要小，不和青霉素起作用，在5～30℃间的蒸汽压较低，回收时温度不超过120～140℃。生产上采用的溶媒主要是醋酸丁酯和戊酯。

青霉素在酸性条件下极易水解破坏，生成青霉素酸，但要使青霉素在萃取时转入有机相，又一定要在酸性条件下。这一矛盾要求在萃取时选择合理的pH及适当浓度的酸化液。而从有机相转入水相中时，由于青霉素在碱性较强的条件下极易碱解破坏，生成青霉噻唑酸，但要使青霉素在反萃取时转入水相，又一定要在碱性条件下。这一矛盾要求在萃取时选择合理的pH及适当浓度的碱性缓冲液。

多级逆流萃取有助于提高青霉素的收得率。生产上一般采用二级逆流萃取。浓缩比选择很重要，如果丁酯用量太多，虽然萃取较完全，收率高，但达不到结晶浓度要求，反而增加溶媒的用量；如果丁酯用量太少，则萃取不完全，影响收率。发酵滤液与丁酯的体积比一般为1.5～2：1。从丁酯相反萃取时为避免pH波动，常用缓冲液。可用磷酸盐缓冲液、碳酸氢钠或碳酸钠溶液等。反萃取时，因分配系数之值较大，浓缩倍数可以较高，一般3～4倍。在一次萃取丁酯中，由于滤液中有大量蛋白质等表面活性物质存在，易发生乳化，这时可加入去乳化剂。通常用PPB，加入量为0.05%～0.1%。

青霉素的精制及烘干

对产品精制、烘干和包装的阶段要符合GMP的规定。精制包括脱色和去热原质、结晶和重结晶等。重结晶可制备高纯度成品。热原质是多糖磷类脂质和蛋白质的结合体，为大分子有机物质，能溶于水，在120℃加热4小时，它能被破坏90%；180～200℃加热半小时或150℃加热2小时能彻底被破坏。它也能被强酸、强碱、氧化剂等所破坏，它能通过一般过滤器，但能被活性炭、石棉滤板等吸附。青霉素的生产中常用活性炭脱色去除热原质，青霉素的生产中一般采用结晶及洗涤法进行精制。

（1）青霉素普鲁卡因盐普鲁卡因青霉素G在水中和乙酸丁酯中溶解度都很小，因此，可以在青霉素盐的水溶液中，加盐酸普鲁卡因或在青霉素游离酸的丁酯萃取液中加普鲁卡因碱的丁酯溶液而制得。反应如下：

（2）青霉素钾盐

①醋酸钾-乙醇溶液饱和盐析结晶

青霉素钾盐在醋酸丁酯中溶解度很小，因此，在二次丁酯萃取液中加入醋酯钾—乙醇溶液，使青霉素游离酸与高浓度醋酸钾溶液反应生成青霉素钾，然后溶解于过量的醋酸钾乙醇溶液中呈浓缩液状态存在于结晶液中，当醋酸钾加到一定量时，近饱和状态的醋酸钾又起到盐析作用，使青霉素钾盐结晶析出，反应如下：

②青霉素醋酸丁酯提取液减压共沸结晶与饱和盐析结晶法一样也是由青霉素游离酸与醋酸钾反应，生成青霉素钾。所不同的是控制结晶前提取液的初始水分，使反应剂加入后，不能像饱和盐析结晶那样立即产生晶体，而是使反应生成的青霉素钾先溶于反应液的水组份中，而后随着减压共沸蒸馏脱水的进行，使反应液中水分不断降低，形成过饱和溶液，晶核产生并逐渐成长并在反应液中析出，得到青霉素钾。

③青霉素水溶液-丁醇减压共沸结晶将青霉素游离酸的醋酸丁酯提取液用碱（碳酸氢钾或氢氧化钾）水溶液抽提至水相中，形成青霉素钾盐水溶液，调节pH后加入丁醇进行减压共沸蒸馏。蒸馏是利用丁醇—水二组份能够形成共沸物，使溶液沸点下降，且二组份在较宽的液相组成范围内，蒸馏温度稳定等特点。进行减压共沸蒸馏是为了进一步降低溶液沸点，减少对青霉素钾盐的破坏。在共沸蒸馏过程中以补加丁醇的方法将水分分离，使溶液逐步达到过饱和状态而结晶析出。

（3）青霉素钠盐青霉素的钠盐生产方法有多种，现举例如下：①从二次丁酯萃取液直接结晶在二次丁酯萃取液中加醋酸钠—乙醇溶液反应，直接结晶得钠盐。②从钾盐转钠盐在二次丁酯中先结晶出钾盐，然后将钾盐溶于水，再加酸将青霉素提取至丁酯中，加醋酸钠—乙醇溶液结晶出钠盐。③从普鲁卡因盐转钠盐一次丁酯萃取液加普鲁卡因丁酯溶液反应，结晶出青霉素普鲁卡因盐。然后将此盐悬浮于水中，加丁酯再以硫酸调pH至2.0，则普鲁卡因盐分解成青霉素游离酸而转入丁酯中，加醋酸钠—乙醇溶液结晶出钠盐。④青霉素水溶液—丁醇减压共沸结晶同该法青霉素钾盐的生产，只是在水溶液抽提时用碳酸氢钠或氢氧化钠。成品的检验及分包装

青霉素是临床应用药物，使用对象是人，因此要特别注意药品的质量。纯品得到后应通过全面严格检验才能出厂，检验的项目和标准一律按药典规定。抗生素一般要求无菌，特别是注射剂更应满足严格无菌要求。因此，成品分包装必须在无菌或半无菌的场所进行。注射剂则应在无菌条件下用自动分装机械分装。药品分包装车间的整个生产流程必须纳入GMP管理标准，以确保药品质量。第三节

青霉素生产工艺过程青霉素的发酵工艺过程工艺流程（1）丝状菌三级发酵工艺流程（2）球状菌三级发酵工艺流程工艺控制（1）影响发酵产率的因素基质浓度、温度、pH值、溶氧、菌丝浓度、菌丝生长速度、菌丝形态（2）工艺控制要点①种子质量的控制②培养基成份的控制③发酵培养的控制加糖控制、补氮及加前体、值控制、温度控制、溶解氧的控制、泡沫的控制、发酵液质量控制青霉素的提取和精制工艺过程工艺流程

（1）工业钾盐生产工艺流程

（2）注射用钾盐生产工艺流程

（3）工业钠盐生产工艺流程

（4）普鲁卡因青霉素工艺流程（接下页）工艺控制

青霉素性质不稳定，在发酵液预处理、提取和精制过程应注意条件温和、速度快、以防止青霉素破坏。预处理及过滤、提取过程是青霉素各产品生产的共性部分，其工艺控制基本相同，只是精制过程有所差别。青霉素普鲁卡因盐的结晶控制结晶过程中应注意控制晶体大小、形态、纯度等。主要采取控制如下条件：晶种、温度、盐酸普鲁卡因水溶液的加入速度、结晶液质量控制（控制好青霉素钠盐结晶水溶液的质量：pH值、浓度、色泽、温度、丁酯含量等）。

醋酸钾-乙醇溶液饱和盐析钾盐的结晶控制在结晶过程中溶液中的水分、酸度和温度、污染数高低、青霉素与醋酸钾的配比对青霉素钾盐的溶解度有很大影响，因而应控制好。第四节

其他工艺技术及技术改造方向现代生物技术的应用

现代生物技术的应用：如固定化酶技术、膜分离技术、基因重组技术等的应用。特别是用现代生物技术对抗生素生产菌进行改良，如利用突变生物合成技术、杂交生物合成技术、细胞融合技术及基因重组技术等手段来