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DB37/T3005—2017猪流行性腹泻病毒分离与IDB37/T3005—2017本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：吴家强、陈智、陈蕾、赵鹏伟、郭立辉、于江、李俊、杜以军、孙文博、丛晓燕、时建立、王金宝。本标准为首次发布。1DB37/T3005—2017猪流行性腹泻病毒分离与RT-PCR检测技术DMEM:细胞培养基(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium)。CPE:致细胞病变效应(cellcytopathiceffect)。4.1.8双抗(100×)(青霉素10000IU/mL,链霉素10000μg/mL)。4.1.10Vero细胞。2DB37/T3005—20174.2RT-PCR检测需要的仪器与试剂4.2.6超低温冰箱：可控温至-70℃。外R5’-AACCCTAAGAGGGGCATAGA-3’,PEDV内F5’-GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3’,PEDV内R5'-AGACCACCAAGAATGTGTCC-3’。5方法5.1样品采集5.1.1活体采样摇一次)。之后加入终浓度为5μg/mL胰酶的维持液(不含血清)。37℃培养3d,其间逐日观察。传3DB37/T3005—20175.4.1样品RNA的提取冰上静置5min。rpm4℃离心15min。5.4.1.4弃去上清，用1mL预冷的75%乙醇轻轻冲洗1.5mL离心管，以12000rpm4℃离心5min。5.4.1.5弃去上清，以7500rpm4℃离心5min,吸取残留液体，在冰盒上静置5min～15min,使5.5第一链cDNA合成将配好的反应体系轻轻混匀，如用0ligo(dT)18(0.1μg/μL),42℃孵育30min。如用Random6结果判定6.1病毒分离检测4(资料性附录)试剂的配制无水乙醇A.21%琼脂糖凝胶琼脂糖0.5×TAE缓冲液A.3细胞生长液含10%的胎牛血清和1%双抗的DMEM。A.4胰酶称取10mg溶于10mL去离子水中，充分溶解后0.22μm滤器过滤除菌，分装灭菌的1.5mL离心管，-20℃保存。A.5接种病毒后维持液含1%双抗的DMEM(不含血清)。5DB37/T3005—2017(规范性附录)RT-PCR反应体系成分12×TSReactionMix成分2RandomPrimer(N19)(0.1μg/μL)orOligo(dT)18(0.1μg/μL)成分3EasyScriptTMRTEnzymeMix成分4RNA成分5DEPC水成分1成分2ForwardPrimer(10μM)成分32×Tra

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