TBWDP 0001-2022 北京市酒庄葡萄酒中生物胺限量及检测方法

ICS67.160.10CCSX62T/BWDP0001-2022LimitanddeterminationofbiogenicaminesinBeijingWinerywines2022-10-28发布北京酒庄葡萄酒发展促进会发布1针对目前北京市酒庄葡萄酒中生物胺含量较低，葡萄酒酿造过程中生物胺含量监测频繁，批次多等问题，我们提出此标准，与现存的GB5009.208-2016标准相比，缩短了生物胺含量的检测时间，提高了其检测限和定量限，满足了酿酒过程调控及生物胺含量测定的需求。本文件按照GB/T1.1《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件参考GB/T5009.208—2016，主要变化如下：——增加了葡萄酒样品前处理方法（交联聚乙烯吡咯烷酮吸附，净化样品，提高检测分辨率——修改了液液萃取所用溶剂（用乙酸乙酯代替乙醚，节省成本并减少有毒有害试剂的使用——修改了检测仪器（检出限从2-5mg/L提高到1.5-4.2µg/L，定量限从5-10mg/L提——修改了流动相和洗脱梯度（检测时间从35min缩短到6min）。建立了更加快速、高效的检测葡萄酒中生物胺的超高效液相色谱方法，缩短了分析时间（6min提高了分析灵敏度和准确度（最低检测限为1.5-4.2μg/L，最低定量限为5-14.1本文件所规定附录为资料性附录。请注意本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由北京酒庄葡萄酒发展促进会提出并归口。本文件起草单位：中国农业大学、北京酒庄葡萄酒发展促进会、北京龙熙堡葡萄酒业有限公司、北京紫雾采邑酒业有限公司、北京沃德酒庄有限公司、北京莱恩堡葡萄酒业有限公本文件主要起草人：游义琳、黄卫东、战吉宬、韩冰、周慧、伍天阳、谢一丁、李礼、刘雪玮、郝越、王明飞。本标准于2022年10月28日首次发布。1北京市酒庄葡萄酒中生物胺限量及检测方法本文件规定了北京市酒庄葡萄酒中色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺含量的测定方法和限量标准的要求。本文件适用于北京市酒庄葡萄酒中生物胺的限量控制和测定方法。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T5009.208-2016食品安全国家标准食品中生物胺的测定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4限量要求根据前期对北京市酒庄葡萄酒中生物胺含量的调查，规定限量标准如表1所示（此限量标准的提出仅针对本标准中的检测方法）。表1生物胺限量标准—338——25原理试样用交联聚乙烯吡咯烷酮净化，丹磺酰氯衍生，乙酸乙酯液液萃取，C18色谱柱分离，超高效液相色谱—紫外检测器检测或二极管阵列检测器检测，以保留时间定性，内标法定量。6试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。6.1.1氢氧化钠（NaOHCAS号：13106.1.2丹磺酰氯（C12H12ClNO2S纯度＞99%，CAS号：605-65-2。6.1.3乙酸铵（CH3COONH4色谱纯，CAS号：631-61-8。6.1.4碳酸氢钠（NaHCO3CAS号：144-55-8。6.1.5乙腈（CH3CN色谱纯，CAS号：75-05-8。6.1.6丙酮（C3H6O色谱纯，CAS号：67-64-1。6.1.7乙酸乙酯（C4H8O2色谱纯，CAS号：141-78-6。6.1.8盐酸（HCl，37%CAS号：7647-01-0。6.1.9氨水（H5NO，25-28%CAS号：1336-21-6。6.2试剂配制6.2.1丹磺酰氯衍生剂溶液：准确称取100mg丹磺酰氯（6.1.2以丙酮为溶剂配制浓度为10mg/mL的衍生剂使用液。置4℃冰箱避光储存，有效期为3个月。6.2.21mol/L盐酸溶液：准确量取8.6mL盐酸（6.1.8）于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。6.2.30.1mol/L盐酸溶液：准确量取1mol/L盐酸溶液（6.2.2）10mL于100mL容量瓶中，用水定容至刻度。6.2.42mol/L氢氧化钠溶液：称取8g氢氧化钠（6.1.1加入100mL水完全溶解。6.2.5饱和碳酸氢钠溶液：称取15g碳酸氢钠（6.1.4加入100mL水溶解，取上清液即为饱和溶液。6.2.60.01mol/L乙酸铵溶液：称取0.77g乙酸铵（6.1.3）溶解于水中，转移至1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。6.3标准品6.3.1色胺（C10H12N2，CAS号：61-54-1）标准品（纯度＞97%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。6.3.2β-苯乙胺（C8H11N，CAS号：64-04-0）标准品（纯度＞99%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。6.3.3腐胺（C4H12N2，CAS号：110-60-1）标准品（纯度＞98%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。6.3.4尸胺（C5H14N2，CAS号：462-94-2）标准品（纯度＞97%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。6.3.5组胺（C5H9N3，CAS号：51-45-6）标准品（纯度＞97%或经国家认证并授予标3准物质证书的标准物质。6.3.6酪胺（C8H11NO，CAS号：51-67-2）标准品（纯度＞98%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。6.3.7亚精胺（C7H19N3，CAS号：124-20-9）标准品（纯度＞99%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。6.3.8精胺（C10H26N4，CAS号：71-44-3）标准品（纯度＞99%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。6.3.91,7-二氨基庚烷（C7H18N2，CAS号：646-19-5）标准品（纯度＞98%或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。6.4标准溶液配制6.4.1生物胺标准储备溶液的配制：分别准确称取10mg各种生物胺标准品，置于10mL小烧杯中，用0.1mol/L盐酸溶液（6.2.3）溶解后转移至10mL容量瓶中，定容至刻度，混匀，配制成浓度为1000mg/L（以各种生物胺单体计）的标准储备溶液。置-20℃冰箱储存，有效期为6个月。6.4.2生物胺标准混合使用液的配制：分别吸取1.0mL各生物胺单组分标准储备溶液，置于同一个10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液（6.2.3）稀释至刻度，混匀，配制成生物胺标准混合使用液（100mg/L）。置-20℃冰箱储存，有效期为3个月。6.4.3生物胺标准系列溶液的配制：分别吸取0.10mL、0.25mL、0.50mL、1.0mL、1.50mL、2.50mL、5.0mL生物胺标准混合使用液（100mg/L6.4.2置于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液（6.2.3）稀释至刻度，混匀，使浓度分别为1.0mg/L、2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、15.0mg/L、25.0mg/L、50.0mg/L，临用现配。6.4.4内标标准储备溶液的配制：准确称取10mg内标标准品(6.3.9)，置于10mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液（6.2.3）溶解后稀释至刻度，混匀，配制成浓度为1000mg/L的内标标准储备溶液。置-20℃冰箱储存，有效期为6个月。6.4.5内标标准使用液的配制：吸取1.0mL内标标准储备溶液（1000mg/L6.4.4）于10临用现配。注：标准溶液的配制浓度以各生物胺单体计算。所有标准溶液配制好后均需转移至密闭棕色容器中，避光贮存。6.5流动相配制6.5.2流动相B：0.01mol/L乙酸铵：称取0.77g乙酸铵（6.1.3）溶解于水中，转移至1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。7仪器和设备7.1超高效液相色谱仪（UPLC配有紫外检测器或二极管阵列检测器。7.2离心机：转速≥5000r/min。7.3涡旋振荡器。7.4水浴装置。7.5氮吹仪。47.6天平：感量分别为0.01g和0.0001g。7.7超纯水器。7.8有机滤膜针头滤器：0.22µm。8分析步骤8.1试样制备准确量取葡萄酒样品10mL，加入200µL内标使用液（100mg/L）(6.4.5)与样品充分混匀，加入0.3g交联聚乙烯吡咯烷酮振荡提取30min，5000r/min离心10min，滤纸过滤，上清液待衍生。8.2试样的衍生准确量取1.0mL上清液于10mL塑料离心管中，依次加入1.0mL饱和碳酸氢钠溶液涡旋混匀1min后置于60℃恒温水浴锅中衍生45min，取出冷却至室温，分别加入100μL氨水（25%6.1.9涡旋混合1min，静置15min，再加入3mL乙酸乙酯（6.1.7涡旋振荡2min，静置分层后，转移上层有机相（乙酸乙酯层）于10mL离心管中，水相（下层）再萃取一次，合并两次乙酸乙酯萃取液，40℃水浴下氮吹近干。加入1mL乙腈（6.1.5）振荡混匀，使残留物溶解，0.22µm有机滤膜针头滤器过滤，待测定。8.3标准的衍生：同8.2。8.4超高效液相色谱参考条件进样量10µL，柱温40℃,流动相A为乙腈，流动相B为0.01mol/L乙酸铵溶液，流速0.3mL/min。梯度洗脱程序见表1。表2梯度洗脱程序表023468.5标准曲线的制作将10µL系列混合标准工作液的衍生液分别注入超高效液相色谱仪，测得目标化合物的峰面积，以系列混合标准工作液的浓度为横坐标，以目标化合物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。标准溶液的色谱图见图A.1。8.6试样溶液的测定将试样的衍生溶液注入超高效液相色谱仪中，测得峰面积，以保留时间定性。根据标准曲线得到待测液中各目标化合物的浓度。若试样溶液中测定组分浓度超过标准曲线上限，应5稀释至标准曲线浓度范围再行测定。9结果计算和表述试样中生物胺各组分含量按标准曲线法或按公式（1）计算获得，计算结果应扣除空白值，并保留两位有效数字。式中：X—试样中生物胺的含量，单位为毫克每升（mg/L);C—从标准曲线得到的试样中溶液生物胺的浓度，单位为毫克每升（mg/L);ƒ—样品稀释倍数。10精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。11检出限和定量限11.1检出限色胺2.2µg/L、β-苯乙胺3.1µg/L、腐胺2.8µg/L、尸胺2.3µg/L、组胺4.2µg/L、酪胺1.5µg/L、亚精胺1.5µg/L、精胺2.8µg/L。11.2定量限色胺7.2µg/L、β-苯乙胺10.4µg/L、腐胺9.5µg/L、尸胺7.7µg/L、组胺14.1µg/L、酪胺4.9µg/L、亚精胺5.0µg/L、