海城市宠物犬沙门氏菌携带情况调查与耐药性分析

沙门氏菌是杆状的革兰氏阴性兼性厌氧菌，属于肠杆菌科，是一种非常重要的人畜共患疾病。目前，国内外已有大量关于人源、鸡源、猪源、食源、沙门氏菌耐药性的研究，宠物犬源沙门氏菌耐药情况国内鲜有报道。目前，我国宠物数量不断增加，人与宠物之间的依赖关系也日益凸显。宠物行业的快速发展，愈来愈多的兽用甚至是人用抗生素被用于宠物疾病的预防和治疗。然而，随着抗生素的广泛应用，沙门氏菌的耐药性也愈来愈严重，这不仅影响临床治疗效果，而且由于人与宠物的密切接触，增加了耐药细菌传给人类的风险。本研究采用PCR技术对海城市宠物犬肛门棉拭子进行分离鉴定，并确定分离株的血清型；Kirby-Bauer纸片扩散法(K-B)测定宠物犬源沙门氏菌分离株对临床常用药物的敏感性，并测定blaOXA、sul2、gyrA、gyrB、floR、tetA和tetC基因，了解锦州地区宠物犬携带沙门氏菌的情况，并从基因水平结合表现耐药进行药物敏感性分析，为锦州地区宠物犬临床用药提供理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株来源犬源沙门氏菌，采自辽宁省海城市宠物门诊宠物犬肛门棉拭子。1.1.2主要培养基和试剂缓冲蛋白胨水（BPW）、普通琼脂培养基均购自青岛海博生物技术有限公司。DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。药敏纸片购于上海化科实验器材有限公司。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.2方法1.2.1样本的采集2018年5～12月，于海城市6家宠物医院随机共采集健康犬82份和患病犬209份，总291份犬肛棉拭子样品。1.2.2细菌分离、鉴定无菌操作把肛门棉拭子放入到5LBPW增菌液中37℃，培养18h。轻轻摇动培养过的样品混合物使其均匀，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18～24h。取过夜培养的菌液，按照DNA提取试剂盒说明提取细菌组总DNA作为模版。参照文献[1]合成沙门氏菌引物，invA（5’→3’）：F:GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA，R:TCATCGCACCGTCAAAGGAACC，片段长度为285pb。PCR反应体系为25μL：BufferMix12.5μL，dNTPs5μL，上下游引物各1μL，ddH2O调整总体积25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳观察。1.2.3血清型鉴定依文献合成我国报道的主要沙门氏菌血清型（O抗原中B、C1、D和E1及鞭毛H抗原H1相和H2相）引物，O抗原（5’-3’）：B群：F:GCGATTAGAGCATGTATATGGR:CAGTTCCAACTTGATACTCAGT，片段大小为216pb；C1群：F：GACATGACTTTGAAATCGGGTA；R:ATTCCTACACGCACTAATACTG，片段大小为760pb；D群：F:GGTAAACTTATCGTCTCCATCA；R:CTTAGCAAGGAAGAGGAACAAT，片段长度为385pb;E群:F:CTTTGCTGAGCTAGGTATAAGTA，R:GCTATTCAAAGACGCTGTATATC，片段长度为1323pb。H抗原(5’-3’)：H1相：F:TGACCCAGAATAACCTGAAC，R:TAACGCAGTAAAGAGAGGAC，片段长度为1450pb；H2相：F:ATGGCACAAGTAATCAACAC，R:TAGTCGGAATCTTCGATACG，片段大小1409pb。PCR反应体系为25μL，各组分如下BufferMix12.5μL，dNTPs5μL，上下游引物各1μL，ddH2O5.5μL。PCR反应条件：扩增循环参数为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。扩增结果经1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统观察结果。1.2.4药敏试验采用K-B琼脂法检测分离菌对常用16种抗菌药物进行药物敏感性试验。1.2.5耐药基因检测参照文献合成检测沙门氏菌5大类抗生素7种耐药基因PCR引物序列（5’-3’）。B-内酰胺类（blaOXA）：F：ACACAATACCATATCCAACTTCGC，R:AGTGTGTTTAGAATGGTGATC，产物大小876bp。四环素类（TetA）：F:TACGGGAGTTTGTTGGA，R:GTATGGAGGATGTGGTTTC，产物大小525bp；tetC：F:ACTTGGAGCCACTATCGAC，R:CTACAATCCATGCCAACCC，产物大小427bp。奎诺酮类（GyrA）：F:TGCCAGATGTCCGAGAT，R:GTATAACGCATTGCCGC，2产物大小69bp；gyrB：F:CGCCTCCCAGACCAAAGACA，R:TCACGACCGATACCACAGCC，产物大小448bp。磺胺类（sul2）：F:CGGCATCGTCAACATAACC，R:GTGTGCGATGAAGTCAG，产物大小722bp。氯霉素类（floR）：F:TATCTCCCTGTCGTTCCAG，R:AGAACTCCGCCGATCAATG，产物大小399bp。PCR反应体系为25μL:BufferMix12.5μL，dNTPs1μL，上下游引物各1μL，ddH2O9.5μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸10min。扩增结果经1.5%琼脂糖凝胶电泳，于紫外凝胶成像系统观察结果。2结果2.1沙门氏菌分离株的PCR鉴定及菌株背景通过PCR检测出9个样本在285pb左右出现明亮的条带，与预计目的条带相符，说明成功的分离到9株沙门氏菌，海城市宠物犬沙门氏菌的携带率为3.09%，PCR电泳图（见图1）；9株沙门氏菌中有7株来源于1岁以内的犬，占77.8%，且集中在10～11月份，说明宠物犬携带沙门氏菌与年龄和季节有一定的相关性，9株沙门氏菌背景见表1。图19株沙门氏菌PCR电泳扩增图2.2沙门氏菌血清型鉴定PCR检测显示9株沙门氏菌种有7株在216pb左右出现条带，有2株在385pb左右出现条带，对其针对H抗原进行PCR检验，对其PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，并通过基因blast比对，确定7株沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌，2株为肠炎沙门氏菌。2.3表观耐药性检测药敏试验结果显示9株对氨基糖苷类（GEN、STR、TOB、AMK、NEO）、大环内脂类（ERY、MID）、磺胺类（SXT）、氯霉素类（CHL）、β-内酰胺类（AML、PEN）、喹诺酮类（NOR、CIP）耐药率100%，四环素类（DOC）耐药率89%，喹诺酮类（LEV）耐药率11%，β-内酰胺类（CTX）敏感率100%。2.4耐药基因检测结果在9株沙门氏菌分离株的7种耐药基因检测中，共检出5种常见耐药基因，分别是β-内酰胺类blaOXA基因，磺胺类sul2基因，氯霉素floR基因，奎诺酮类gyra和gyrb基因。检出率为71.4%（5/7）每株菌对5种耐药基因检出率100%。没有检测到四环素类耐药基因。3讨论已有许多宠物犬携带沙门氏菌报道，王元兰等对合肥市宠物犬采集的746份样本中沙门氏菌进行了调查，分离率为2.55%，主要以肠炎沙门氏菌为主，其次是德尔卑沙门氏菌。LeahyAM等对在2013年5月至2014年12月间对7个德克萨斯州动物收容所554只犬粪便样本进行沙门氏菌的分离鉴定，检测出27个阳性样本，其携带率为4.90%；且与腹泻存在相关性（p=0.09），沙门氏菌的流行率与年龄、性别没有显著差异，常见的血清型是Newport沙门氏菌(22%)和Javiana沙门氏菌(15%)。WillenJ.Botha等对74只自然感染细小病毒宠物犬和42只健康犬的粪便样本进行沙门菌的分离、药敏试验和血清分型，共分离到32株沙门氏菌，感染犬和健康犬的粪便沙门氏菌的携带率分别为22%和31%，无统计学差异；且与年龄、体重住院时间之间无显著的相关性，只有9株沙门氏菌鉴定出4个血清型，其中4株Heidelberg沙门氏菌、2株Cotia沙门氏菌、2株Chile沙门氏菌、1株Braenderup沙门氏菌。本研究表明在海城市宠物犬291份样本中，沙门氏菌检出率为3.09%（9/291），发病样本的携带率为3.35%，健康样本携带率为2.44%；12月龄以内阳性犬占78%，12月龄以上的阳性犬占22%，雄性占66.7%，雌性占33.3%；阳性犬检出沙门氏菌的时间集中分布在9～11月份。说明锦州宠物犬源沙门氏菌携带情况可能与宠物犬年龄和感染季节有一定的相关性，与性别及健康状况无关，这一结果也与WillenJ.Botha报道基本一致，但血清型上述文献报道有一定的差异性。说明宠物犬沙门氏感染不同地区分离到的血清型存在一定区域性。宠物犬沙门氏感染年龄在12个月龄以内幼龄犬的原因可能是与缺乏成熟的肠道微生物群有关；同时，幼龄犬免疫系统不够完善，免疫力低下所致，而随着年龄的增长，免疫力提高及宠物主人提供良好的环境和管理条件，致使发病率下降。近年来，由于宠物抗生素的不合理使用，导致沙门氏菌耐药现象越来越严重，已成为危害人类健康的一大难题。轩慧勇等从新疆乌鲁木齐市77份宠物粪便中分离到沙门氏菌36株，除了头孢噻呋、安普霉素、阿米卡星、硫酸庆大霉素和多黏菌素外，宠物犬源沙门氏菌对其他被检抗菌药药物的耐药性高达97.0%以上，tetB、blaTEM、blaOXA，qurS、oqxA、oqxB、aac(6’)-Ib-cr、ant(3’)-Ia和floR的基因检出率在97.0%以上，而aadA2基因的检出率也在72.0%以上。VictorA等在2016年8～10月西印度群岛格林纳达144只非腹泻犬的粪便样本中分离到35株沙门氏菌进行药敏试验显示，对环丙沙星和头孢噻呋等人类沙门氏菌病患者目前使用的药物没有耐药性。一个分离株（2.9%）对新霉素有耐药性，两个分离株（5.7%）对新霉素有中度敏感性，另一个分离株（2.9%）对四环素有中度敏感性。Tadesse等对埃塞俄比亚中部地区人和动物沙门氏菌β-内酰胺类和奎诺酮类抗生素耐药基因检测是发现blaOXA检出率79.1%，sul2检出率30.3%。本研究在对9株沙门氏菌分离株进行药敏实验时发现，所有菌株对头孢噻呋均敏感，而对复方新诺明、青霉素、庆大霉素、妥布霉素、亚胺培南和氯霉素耐药性最强。这可能与临床用药和检测地区有关，同时，不同国家、地区在宠物犬治疗或药物预防过程中使用药物的差异、剂量及不合理应用的因素也不同。对9株