光度测定法BET检查技术学习培训课件

光度测定法BET检查技术（一）、光度测定法方法学分类（二）、光度测定法原理（三）、光度法BET的试验材料（四）、动态显色法BET（五）、动态浊度法BET（六）、终点显色法BET2光度测定法BET检查技术（一）、光度测定法方法学分类3光度测定法（定量法检测）浊度法显色法动态浊度法终点浊度法动态显色法终点显色法(比浊法)(比色法)动态终点法(湛江安度斯发明专利)（二）、光度测定法原理光电转换原理光度测定法是利用鲎试剂与内毒素的混合物在反应过程的透光度变化与内毒素浓度的关系来定量检测内毒素的一种方法。当一束光线进入如下光电转换装置时，该装置将产生电流I，我们称I为透光强度。4入射光反应混合物透射光光电池I透光容器设：初始时的透光强度为Is，某时刻的透光强度为It

定义1：透光度（Rt）：

Rt=It/Is(%)

初始时It=Is，Rt=100%，Rt曲线变化趋势是由高至低。定义2：吸光度(OD)：

OD=-lg(It/Is)

初始时It=Is，OD=0，OD曲线变化趋势是由低至高。选择不同的参数(Rt或OD)将得到不同变化趋势的动态曲线。5T(分)IsItIeITAL与内毒素反应的动态曲线(Rt-T曲线)以透光度（Rt）为纵座标，时间（T）为横座标，把TAL与内毒素反应引起反应混合液透光度的变化连续地描绘在座标系中，便得到该反应的动态曲线如图：6Rt（%）T（分）反应动态曲线100孕育期反应期结束TAL与内毒素反应的动态曲线(OD-T曲线)以吸光度（OD）为纵座标，时间（T）为横座标，把TAL与内毒素反应引起反应混合液吸光度的变化连续地描绘在座标系中，便得到该反应的动态曲线如图：7ODT（分）反应动态曲线0孕育期反应期结束动态曲线的特点把标准内毒素制备成三个浓度C1、C2、C3（C1>C2>C3），分别与TAL反应，描绘出反应的动态曲线如下图：8C3Rt（%）T（分）C2C1分析动态曲线可看出：内毒素浓度越高，孕育期越短；内毒素浓度越高，反应期曲线越陡；内毒素浓度越高，进入结束期越快。光度测定法BET试验的相关变量9C3100Rt（%）T（分）C2C1相关变量：

内毒素浓度(C)

透光度(Rt或OD)

反应时间(T)1）动态法原理固定透光度(Rt)，建立内毒素浓度与反应时间关系的标准曲线（C-T曲线），用供试品的反应时间比对标准曲线，得出供试品的内毒素浓度。这里的反应时间是指反应混合液的透光度到达预设透光度值（Rt）的时间。10回归分析Rt%预设透光度值R0T1T2T395100T(分)C1C2C3LgT=b-kLgCLgTT3T2T1C3C2C1LgC（1）建立标准曲线11（2）测定样品内毒素浓度（Cs）用鲎试剂与未知内毒素含量的供试品(S)反应，得到反应时间Ts，比对C-T关系的标准曲线，可得出供试品的内毒素含量Cs。12比对标准曲线TsT(分)Rt(%)R0CsLgT=b-kLgCLgCCsTsLgT952）终点法原理固定反应时间（T），建立内毒素浓度与透光度关系的标准曲线（C-Rt曲线），用供试品的透光度比对标准曲线，得出供试品的内毒素浓度。13Rt(%)T(分)C1C2C3100R1R2R3预设反应终止时间T0RtR3R2R1C3C2C1Rt=b-K·C回归分析（1）建立标准曲线14（2）测定样品内毒素浓度（Cx）用鲎试剂与未知内毒素含量的供试品（X）反应，得到透光度值Rx，比对C-Rt关系的标准曲线，可得出供试品的内毒素含量Cx。15CxToT(分)Rx100Rt(%)Rt(%)Rt=b-K·CRxCx比对标准曲线（三）、光度法BET的实验材料光度测定仪和BET软件试剂实验用具1617光度测定仪RT-6500酶标分析仪RT-6100酶标分析仪ELx808IU酶标仪18光度测定仪便携式检测仪动态试管检测仪全自动式细菌内毒素检测软件19试剂光度法BET鲎试剂20鲎试剂动态浊度法(KTA)终点浊度法(ETA)动态显色法(KCA)终点显色法(ECA)规格1.25ml/支—0.35ml/支1.25ml/支0.45ml/支检测范围10-0.01EU/ml3-4个数量级—50-0.005EU/ml3-4个数量级0.5-0.05EU/ml1个数量级试剂内毒素标准品

RSE或经RSE标化的CSE细菌内毒素检查用水

内毒素含量小于0.005EU/ml且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。21试验器具器具分类器具名称反应试管玻璃试管（外径8×75mm或10×75mm）、微孔平板稀释容器大口径玻璃试管移液器具刻度吸管及洗耳球，或移液器及无热原吸头等仪器光度仪、天平、电热干燥箱（温度250℃以上）、旋涡混合器其他试管架、异丙醇浸泡的无纺布、镊子、剪刀、砂轮、封口膜或医用胶布、标记纸等22凡是与供试品或反应试剂接触的器具，必须经除热原处理。动态显色法

（KineticChromogenicassay）23（四）、动态显色法可测范围最广，

干扰最小检测反应混合物

的色度到达某一预先设定的透光度/吸光度值所需要的反应时间反应时间对数值与细菌内毒素浓度的对数值成反比的关系。24反应动态曲线动态显色法反应机理示意图25Peptide-PNA（酶作用物*）内毒素凝固酶凝固酶原pNA（对硝基苯胺）Peptide黄色405nm测光度值*通常把酶作用物称为显色基质或底物动态显色法特点发达国家使用最广泛的光度法灵敏度高：0.001~0.005EU/ml检测范围广：4个数量级，线性达0.999检测品种：适应广抗干扰能力强26动态显色法试验程序试验程序：

27仪器试剂用具标准曲线的可靠性试验干扰试验检查法试验准备方法验证日常检查一）、试验准备检测波长：405nm对应的反应管或反应板动态显色法鲎试剂（KCA）内毒素标准品：CSE/RSE细菌内毒素检查用水旋涡混合器、微量振荡器、移液器、稀释管等28内毒素测定仪检测试剂试验用具二）、标准曲线的可靠性试验试验目的29验证实验室的条件验证实验人员的实验技能是否满足BET试验的要求验证实验所用试剂二）、标准曲线的可靠性试验30试验程序：CSE/RSE鲎试剂内毒素测定仪预热复溶、混合反应容器，每个浓度平行三管，阴性对照平行二管插入反应容器混匀稀释为至少3个浓度的稀释液，稀释度为2～10倍，最低浓度不得低于所用鲎试剂的最低检测限数据分析及结果判断复溶1234567判断标准1、阴性对照的反应时间(TNC)应大于标准曲线最低浓度的反应时间(Tλ)2、标准曲线的相关系数|r|≥0.9803、变异系数CV<10%31药典要求厂家建议值二）、标准曲线的可靠性试验二）、标准曲线的可靠性试验

1、试剂32名称厂家装量规格动态显色法TAL安度斯0.35ml/支10~0.01EU/ml内毒素标准品（CSE）中检院100EU/支BET水（W）安度斯25ml/瓶内毒素<0.003EU/ml2、仪器及软件信息仪器名称RT6500酶标分析仪厂家深圳雷杜编号671401004波长405nm软件名称生物探针4.033二）、标准曲线的可靠性试验采用数据库管理二）、标准曲线的可靠性试验3、反应溶液制备选择标准曲线浓度：2.0、0.2、0.02EU/ml；取CSE1支，打开加入1ml水复溶，旋涡混合15分钟，得原液100EU/ml的内毒素溶液记为E1004、复溶鲎试剂34E100E100.4ml1.6mlWE20.2ml1.8mlWE0.20.2ml1.8mlWE0.020.2ml1.8mlW二）、标准曲线的可靠性试验

5、进入软件，设置试验参数及反应项目356、布板与测试36二）、标准曲线的可靠性试验

7、加样：按项目布板位置加样0.025mlTAL溶液＋0.025ml内毒素溶液,每个浓度平行三孔，NC平行二孔378、反应：把反应板放置仪器中，设置反应60分钟二）、标准曲线的可靠性试验9、试验完成后进行数据分析阴性对照反应时间大于标准曲线最低浓度反应时间相关系数绝对值大于0.98038CV＜10％9、试验完成后进行数据分析E2.0E0.2E0.0239NC10、结果判断40标准曲线范围：2.0~0.02EU/mlTNC

＞T

λ；|r|≥0.9997,CV<10%标准曲线符合规定!三）干扰初筛试验目的及原理

目的：初步筛选出供试品的无干扰浓度原理：在供试品溶液中添加已知浓度的标准内毒素溶液，计算内毒素回收率，判断供试品浓度对BET的干扰情况。41干扰初筛试验反应项目设置42编号反应项目内毒素浓度被加入内毒素的溶液平行管数A供试品溶液无供试品溶液至少2B供试品回收溶液标准曲线的中点（或附近点）的浓度（设为λm）供试品溶液至少2C标准曲线至少3个浓度（最低点设定为λ）检查用水每一浓度至少2D阴性对照无检查用水至少2A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液

B为加入

m内毒素且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液

C为用于制备标准曲线的内毒素标准溶液

D为阴性对照试验步骤供试品限值的确定试剂的选择MVD/MVC的计算反应溶液的制备加样及反应结果判断43123456判断标准1、阴性对照的反应时间（TNC）大于标准曲线最低浓度的反应时间（Tλ）2、标准曲线的相关系数|r|≥0.9803、回收率R满足：50%≤R≤200%4、变异系数CV<10%44药典要求厂家建议值三）干扰初筛试验1、样品名称及内毒素限值45样品名称规格内毒素限值注射用头孢噻肟钠1.0g/瓶L=0.050EU/mg干扰初筛试验2、试剂、仪器、软件信息46名称厂家装量规格动态显色法TAL安度斯0.35ml/支10~0.01EU/ml内毒素标准品（CSE）中检院100EU/支BET水（W）安度斯25ml/瓶内毒素<0.003EU/mlRT6500/671401004深圳雷杜生物探针4.0安度斯干扰初筛试验3、选择标准曲线范围2.0~0.02EU/ml，λ=0.02EU/ml；λm=0.2EU/ml；4、MVC的计算MVC=λ/L=0.02/0.050=0.40（mg/ml）

47干扰初筛试验5、各反应溶液的制备1）溶液C的制备

2）溶液A的制备取样品1瓶溶解后，稀释至10mg/ml(S10)、5mg/ml(S5)和2.5mg/ml(S2.5)48E100E100.4ml1.6mlWE20.2ml1.8mlWE0.20.2ml1.8mlWE0.020.2ml1.8mlW干扰初筛试验3）溶液B的制备（近似法）：0.9mlS10+0.1mlE2.0S10E0.20.9mlS5+0.1mlE2.0S5E0.20.9mlS2.5+0.1mlE2.0S2.5E0.2496、加样及反应反应项目设置50编号反应项目平行管D阴性对照BET水C标准曲线E0.02E0.2E2.0A供试品溶液10、5、2.5mg/mlB供试品回收溶液10、5、2.5mg/ml中添加0.2EU/ml的内毒素溶液516、加样及反应复溶鲎试剂运行软件合并鲎试剂溶液填写试验参数分别加入反应溶液D、C、A和B设置各孔反应项目分别加入鲎试剂溶液放置酶标仪中，点“开始”10mg/ml回收率5mg/ml回收率TNC（>3600s）>Tλ相关系数绝对值|r|=0.9996>0.980试验有效有干扰2.5mg/ml回收率无干扰无干扰7、试验完成后进行数据分析528、结果判断53标准曲线范围：2.0~0.02EU/mlTNC

＞T

λ；|r|≥0.980；CV<10%标准曲线符合规定!注射用头孢噻肟钠浓度≤10mg/ml时，无干扰四）干扰试验目的：确定日常检测供试品的稀释倍数或检测浓度建立一个品种的光度BET法，需三批样品选择3批供试品在同一浓度进行干扰试验反应项目设置同干扰初筛试验54判断标准1、阴性对照的反应时间（TNC）大于标准曲线最低浓度的反应时间（Tλ）2、标准曲线的相关系数|r|≥0.9803、各批样品的回收率R满足：50%≤R≤200%4、变异系数CV<10%55药典要求厂家建议值四）干扰试验1、样品名称及内毒素限值56样品名称规格内毒素限值注射用头孢噻肟钠1.0g/瓶L=0.050EU/mg干扰试验2、试剂、仪器、软件信息57名称厂家装量规格动态显色法TAL安度斯0.35ml/支10~0.01EU/ml内毒素标准品（CSE）中检院100EU/支BET水（W）安度斯25ml/瓶内毒素<0.003EU/mlRT6500/671401004深圳雷杜生物探针4.0安度斯干扰试验3、根据干扰初筛试验结果，确定选择供试品的无干扰浓度58无干扰选择回收率接近100%的稀释倍数*本试验选择5mg/ml

为干扰验证浓度。无干扰无干扰594、反应项目设置溶液编号反应项目平行管D阴性对照BET水OOC标准曲线E0.02OOE0.2OOE2.0OOA1供试品溶液5.0mg/mlOOB1供试品回收溶液5.0mg/mlE0.2OOA2供试品溶液5.0mg/mlOOB2供试品回收溶液5.0mg/mlE0.2OOA3供试品溶液5.0mg/mlOOB3供试品回收溶液5.0mg/mlE0.2OO5、各反应溶液的制备601）溶液C的制备：2）溶液A的制备：3）溶液B的制备（近似法）：E100E100.4ml1.6mlWE20.2ml1.8mlWE0.20.2ml1.8mlWE0.020.2ml1.8mlW取样品1瓶溶解后，稀释至5.0mg/ml(S5)0.9mlS5.0+0.1mlE2.01.0ml

S5.0E0.2干扰试验6、复溶2支鲎试剂，待澄清后，合并；7、加样及反应618、试验结果相关系数绝对值|r|=0.9997>0.980TNC（>3560s）>Tλ试验有效试验有效试验有效试验有效无干扰62

TNC

＞T

λ,|r|＞0.980,CV<10%标准曲线符合规定!

注射用头孢噻肟钠浓度5.0mg/ml时，无干扰；可以作为日常检查浓度。试验有效9、结果判断63五）检查法（日常检查）根据干扰试验结果，选择无干扰的供试品浓度进行BET日常检查各反应溶液的制备及反应项目设置与干扰试验相同64判断标准1、阴性对照的反应时间(TNC)大于标准曲线最低浓度的反应时间(Tλ)2、标准曲线的相关系数|r|≥0.9803、各批样品的回收率R满足：50%≤R≤200%4、变异系数CV<10%若内毒素含量＜L，判供试品符合规定；若内毒素含量≥

L，判供试品不符合规定。65

药典要求厂家建议值五）日常检查1、样品名称及内毒素限值66样品名称规格内毒素限值注射用头孢噻肟钠1.0g/瓶L=0.050EU/mg溶液编号反应项目平行管D阴性对照BET水OOC标准曲线E0.02OOE0.2OOE2.0OOA供试品溶液5.0mg/mlOOB供试品回收溶液5.0mg/mlE0.2OO2、反应项目设置67标准曲线范围2~0.02EU/ml,反应平均时间561.0~2419.3秒。相关系数绝对值|r|=0.9997>0.980TNC（>3600s）>Tλ试验有效试验有效3、试验结果684、结果判断内毒素浓度（EU/ml）0.020.22.0反应时间（秒）2419.3120356169标准曲线信息样品批号123检测浓度（mg/ml）5.05.05.0反应时间（S）354012021437回收率（%）92.9999.44107.78内毒素值（EU/mg）0.0010.0370.021结果判断合格合格合格结果判断实验成本:动态显色微孔板法BET的实验成本与凝胶法BET相同甚至更低!是性价比最高的光度法。（五）、动态浊度法是凝胶法的扩展第一个定量方法检测反应混合物的

浊度到达某一预先设定的透光度/吸光度值所需要的反应时间反应时间对数值与细菌内毒素浓度的对数值成反比的关系。71反应动态曲线动态浊度法试验程序试验程序：

72仪器试剂用具标准曲线的可靠性试验干扰试验检查法试验准备方法验证日常检查试验准备检测波长：340nm~660nm反应试管或反应板动态浊度法鲎试剂（KTA）内毒素标准品：CSE/RSE细菌内毒素检查用水旋涡混合器、移液器、稀释管等73内毒素测定仪检测试剂试验用具动态浊度法动态浊度法除了使用动态浊度法鲎试剂和试验波长更宽外，其他实验方法、条件、要求以及实验操作与动态显色法完全相同。74（六）、终点显色法鲎试剂与内毒素反应，反应达到预设的反应时间时，加入终止液终止反应，然后用分光光度计或酶标仪在405nm波长测定吸光度值（OD）；吸光度值（OD）与内毒素浓度（C）成正比。利用标准内毒素建立OD-C的标准曲线，利用标准曲线定量测定供试品的内毒素含量。75终止时间（六）、终点显色法终点显色法系统组成1、终点显色法细菌内毒素检测试剂盒2、酶标仪-405nm波长3、微孔板恒温仪4、微量振荡器5、旋涡混合器6、移液器和无热原吸头等7、微孔细菌内毒素检查反应板76终点显色法试验程序试验程序77仪器试剂用具标准曲线的可靠性试验干扰试验检查法试验准备方法验证日常检查试验准备酶标仪检测波长：405nm对应的反应板终点显色法鲎试剂（ECA）内毒素标准品：CSE/RSE细菌内毒素检查用水旋涡混合器、微量振荡器、移液器、稀释管等78光度测定仪检测试剂试验用具终点显色法日常检查举例试剂及器具79终点显色法试剂盒终点显色法试剂内毒素工作标准品（CSE）BET水反应终止液酶标仪405nm微孔平板96孔，无热原微孔平板恒温器提供37℃恒温环境微量振荡器混匀反应混合液旋涡混合器混匀供试