Illumina测序基础知识

第一个要给大家讲得,就是它这个flowcell。Flowcell翻成中文,就叫“流动池”。我们来瞧这个图片。图片当中,我们瞧到一个象载玻片大小得芯片。这个芯片里面,就是做了8条通道。在这个通道得内表面,就是做了专门得化学修饰。它得化学修饰,主要就是用2种DNA

引物,把它(2种DNA引物)种在玻璃表面。这两种(DNA引物得)序列就是与接下来要测序得DNA文库得接头序列相互补得。而且这2种引物就是通过共价键,连到Flowcell上去。之所以要用共价键连到Flowcell上去,就是因为接下来有大量得液体要流过这个Flowcell,只有有共价键连接得这些DNA,才不会被冲掉。这就就是Flowcell。再接下来,讲一下文库、与文库得制作(过程)所谓得DNA文库,实际上就是许多个DNA片段,在两头接上了特定得DNA接头,型成得DNA混合物。文库有2个特点,第1个特点,就是当中这一段插入得DNA,它得序列就是各种各样得。第2个特点,它得两头得接头序列,就是已知得,而且就是人工特地加上去得。要做这个文库,首先就是把基因组DNA,用超声波打断。然后打断之后,两头用酶把它补平,再用Klenow酶在3’端加上一个A碱基。然后,再用连接酶把这个接头给连上去。连好了接头得DNA混合物,我们就称为一个“文库”。英文也称作“library”。做好了Library之后,就要做桥式PCR了。桥式PCR,实际上就是把文库种到芯片上去,然后进行扩增,这样得一个过程。这个过程,首先就是把文库加入到芯片上,因为文库两头得DNA序列,与芯片上引物就是互补得,所以,就会产生互补杂交。杂交完了之后,我们在这里面加入dNP与聚合酶。聚合酶会从引物开始,延着模板合成出一条全新得DNA链来。新得这条链,与原来得序列就是完全互补得。接下来,我们再加入NaOH碱溶液。DNA双链在NaOH碱溶液存在下,就解链了。而且被液流一冲,原来得那个(模板)链,也就就是没有与芯片共价连接得链,就被冲走了。而与芯片共价连接得链,就被保留下来。然后,我们再在液流池里加入中性液体,主要就是为了中与这个碱液,在加入中与液之后,整个环境变成中性了。这时侯,DNA链上得另外一端,就会与玻璃板上得第二种引物,发生互补杂交。接下来,我们加入酶与dNTP,聚合酶就延着第二个引物,合成出一条新链来;然后,我们再加碱,把2条链解链解开;然后,我们再加中与液,这时侯,DNA链会与新得引物杂交。再加酶,再加dNTP,又从新引物合成出新得链来。连续重复这一过程,DNA链得数量,就会以指数方式增长。在桥式PCR完成之后,接下来要做得工作,就就是要把合成得双链,变成可以测序得单链。办法就是通过一个化学反应,把其中一个引物上得一个特定得基团给切断掉。然后,再用碱溶液来洗这个芯片。这时侯,碱让DNA得双链解链,那根被切断了根得DNA链就被水冲掉了。留下那根共价键连在(芯片)上面得链。接下来,再加入中性溶液,然后在这个中性溶液里面加入测序引物。好,接下来正式得测序工作就开始了。那么,在测序得时侯,加入进去得,最主要就是2个东西:一个就是带荧光标记得dNTP。而这个dNTP,它还有一个特点,它得3’末端就是被一个叠氮基堵住得。然后,再加一个聚合酶,聚合酶就会选择:哪一个dNTP就是与原来位置上得那个碱基就是互补得,根据互补性原理,把这个dNTP合成到新得这个DNA链上去。因为这个dNTP得3’端就是被一个叠氮基团堵住了,所以,它一个循环只能延长一个碱基。然后,它就停在那儿了。合成完了之后,就用水把多余得dNTP与酶给冲掉。冲掉之后,就放到显微镜下,去进行激光扫描。根据发出来得荧光来判断它就是哪个碱基。因为4种dNTP,它每一种dNTP上面标得荧光素都不一样,根据红、黄、蓝、绿,它出来得哪种颜色,那么,就可以倒过来推出来,这个新合成上去得碱基,就是哪种碱基。因为新合成得碱基,就是与原来位置(得碱基)就是互补得,所以,又推出模板上那个碱基就是哪个。这一个循环完成之后,就加入一些化学试剂,把叠氮基团与旁边标记得荧光基团切掉。切完了之后,3’端得羟基就暴露出来。再接下来,加入新得dNTP与新得酶,然后,又延长一个碱基。新延长完一个碱基之后,把多余得酶与dNTP冲掉,再进行一轮显微得激光扫描,再读一下这个碱基就是什么。不断重复这个过程,可以重复上百次,到几百次,就可以把上百个碱基,甚至更多碱基得序列读出来。那么,什么就是Index哪？就是因为Illumina得评委会个测序量很大,往往一个样本,用不了那么几亿条DNA。所以,科学家就想了一个办法。在文库得接头上做了一些标记,每一个样本,它有一个特定得接头,每个接头里面,它有一段特定得序列。这段特定得序列,我们就称为Index。也有人把它叫做Barcode,反正,表达得就是一个意思:这么一段特定得序列,标记了样本得来源。那么,要读这个Index得序列,先用碱把上面这根测完“Read1”得序列,把上面这根DNA链给解链掉。解链掉之后,再加入中性液,然后,加入“Read2”这个测序引物。Read2测序引物结合得位点,正好,就在这个Index序列得旁边。接下来,就进行第2轮测序,一般来说,就是读6到8个碱基。把这6到8个碱基读下来,我们就可以知道,这某一个具体得一段DNA,它来自于原始得哪个样本。这就是Illumina得最核心得另外一个技术,就就是双端测序。那么双端测序,就就是说,一根DNA链,除了从正向读一遍,还可以从DNA得负向,再读一遍。这一下子就把Illumina测序得有效长度加了一倍。这就是非常有实际用途得。那么这个倒链得过程,就是这样,先让这个DNA先合成,合成出来这根互补链。有了这个互补链之后,用一个化学试剂,在原来这根链得根上切一下。切一下,原来这根模板链就掉了,剩下那根互补链。再接下来,就进行第2端得测序。第2端得测序原理,与第一端得测序原理就是一样得。加上了“Read3”得这个引物,依次往下,一个一个碱基地往下读。那么最重要得事情就是什么呢？一个点,经过几百个循环,就读出了几百个碱基。但实际上,这个芯片上可以有上亿个点,上亿个“cluster”,也就就是“簇”。那么上亿个“cluster”,每个循环,它都可以读出地么多序列,这就是Illumina测序非常强大得原因。因为就是成千上万,准确说就是上亿上链都在合成,这个就得到了很大得一个测序数据量。IlluminaHiSeq测序仪得工作原理。也就就是芯片上发生了这么多变化,HiSeq就是如何把这些信息给读出来,并且把扫描出来得荧光信号,又通过怎样一系列得加工,变成可以识别得“A、C、G、T”得碱基序列得。HiSeq首先就是一台高精度得显微光学扫描仪。然后再配上了一整套得液流系统,与计算机软硬件,再加温控系统,组成这样一台测序仪。其中最核心,也就是结构最复杂得,就是它得光学系统。前一期,我们讲了,Illumina测序仪主要就是靠4种dNTP分别带有不同得荧光基团,在被激光照了之后,发出不同颜色得荧光。再通过对光得颜色得分辩,可以判断出到底就是哪个碱基。这里,我们要说明一下:感光元件CCD,它本身就是色盲。所以,它一定要配合滤光片,才能分辩出颜色来。那我们先来瞧一下,HiSeq得光路图。左边这两个元器件,就就是激光器。一个发出红色激光,另一个发出绿色激光。其中红色激光主要就是激发A与C,这两种碱基上得荧光基团;而绿色激光主要就是激发G与T,这两种碱基上得荧光基团。红色与绿色这两束光,通过一面半透半反镜,组成一道激光。这道激光打在Flowcell上。那么请注意,Flowcell就放在这个位置。在Flowcell里面,结合在DNA上得那个荧光基团在激光得照射下,就发出荧光。荧光通过3面半透半反镜,与1面全反镜,被分成4条光路,这4道光线,分别通过一道滤光片,这4张滤光片得滤过波长不一样。这样,这4道光在经过了滤光片之后,就变成了4种颜色不同得光线。然后,这4条颜色不同得光线,各自照在一面反射镜上,通过反射镜进入到CCD。这4个CCD就记录到不同颜色得光线。HiSeq得光线扫描就是“线扫描”,与传统得相机不一样,传统得相机就是面扫描。HiSeq采取了一种特定得叫“TDI”线扫描方式,TDI就是Timedelayintegration得缩写。在HiSeq上之所以采取TDI扫描方式,因为它有非常明显得优点。第一个优点,就就是它得扫描速度非常快,在HiSeq2500上,从Flowcell得一个Lane得一头扫到另外一头,也就就是一个“Swath”得扫描时间,大概只有20秒种不到。第二个好处,就就是它得扫描精度非常高。在最新得HiSeqV4版试剂上,它得光点密度,大概可以达到每平方毫米90万个点,要扫描清楚这么高密度得光点,扫描仪得扫描精度就是可想而知得。TDI扫描得第三个好处,就是这种方式,可以把Flowcell得上表面、与下表面都扫描到。接下来,我们再要详细介绍这张Flowcell。那么,先来瞧一下,这张flowcell有点象一张载玻片,在这一张片子里面,我们可以瞧到,它做了8条通道。每条通道,我们称为一个Lane。这8个Lane之间,相互就是隔绝得。每个Lane得两端各有一个小孔。这两个小也孔,就就是液流流进、流出得地方。每个Lane得上表面与下表面,都分别以共价键得方式,种了2种DNA引物。这两种DNA引物,就是与文库接头得两头序列相互补得。上一期(节目)我们已经说明了这一点。一个Lane里面,分成2个面,上表面、与下表面。上表面与下表面,都种了DNA引物,也都就是可以产生测序数据得。在每一条Lane得每一个面,又被分成了3个扫描通道,每个道被称为一个“swath”。每条Swath就是从头到底被连续扫描得。但就是它得数据,在进行数据分析得时侯,就是被分割成16个小方块。这每一个小方块,被称为一个“tile”。这样一张Flowcell,总共就就是768个Tile。每个Tile在扫描得时侯,会根据4种颜色,产生4张照片。扫描完了之后,就要进行图像处理。扫描出来得最原始得文件,它得格式就是“、tiff”文件。Tiff文件记录了每个像素点上采集到得光强度。Tiff文件得优点就是它就是完全无损,保留了所有得原始信息。但它也有它得不足之处。它得不足之处就就是它得这个文件太大了。它得数据量很大,既不便于数据得传输,也不便于数据得存储。接下来,计算机软件就把图像文件转化成光点文件。光点文件叫“、BCL”文件。也就就是“Basecalling”得英文缩写。要把图像文件,转化成BCL文件,就就是把4种颜色得4张照片,组合在一起,变成一张有4种颜色得彩色照片。这其中首先要解决得,就是4张照片在空间位置上得匹配问题,因为4张照片就是通过4个CCD分别拍下来得,所以,会有一定得空间上得偏差。软件要通过对4张照片上,亮点相互比对,找到最合适得、匹配得位置。这里,我们要说明一下,如果被测得文库就是碱基不平衡得文库,在这个空间匹配上就会遇到问题。什么叫碱基平衡呢？也就就是说,在测序过程当中,每个循环,A、C、G、T四种碱基,都就是比较均匀在存在得。最典型就是人全基因组文库,这就是一个典型得碱基平衡文库。那什么就是碱基不平衡文库呢？最典型得,就就是PCR扩增子产生得文库。PCR扩增子得特点:PCR就是有特定得起始位点得,一个特定得测序循环中,几乎所有得片段都就是同一种碱基,而剩下得3种碱基,就特别少。这在反映到照片上去得时侯,就变成:一张照片特别亮,光点很多。而其它得三张照片就特别暗,上面得光点就很少。这时侯,要软件做空间上得比对,软件就会觉得困难,因为对于那几张暗得照片,软件很难判断上面得光点,就是否与那张亮得照片上得光点真正对得上。结果,就就是判断出来得可靠性变差。最后,就就是测序得数据质量变差,有效数据量也会变少。要解决这个问题,办法就是在测序过程中掺入一些碱基平衡得文库。例如掺人全基因组文库。或者也可以掺Illumina提供得标准得PhiX文库,这些都就是碱基平衡文库。它得作用,就是在每个循环当中,为每一种颜色得照片,都提供足够多得亮点。这样,它可以弥补那些不平衡得文库当中缺亮点得问题。当把4种颜色得光点组成一个文件之后,软件就会生成一个“、BCL”文件。“、BCL”文件就就是光点文件,它对每个光点,记录了以下得内容。首先一个光点处在哪个Lane里面。其次,这个光点在这个Lane得哪个Tile里面。第3,就就是这个亮点在这个Tile得X轴与Y轴得座标位置。第4,就是记录了这个光点当中“红、黄、蓝、绿”四种光得对应得光强。这个图就是BCL文件得一个示意图。实际上,BCL文件就是二进制文件,无法拿来直接阅读。也正就是因为BCL文件难于阅读,并且很难改动,所以,BCL文件几乎不存在做假得可能。在测序过程当中,有许多客户会要求测序公司提供原始得测序数据,如果客户就是包Lane、或者包Flowcell得,一般测序公司就是可以提供BCL文件得。客户在拿到BCL文件之后,可以用“BCL2FASTQ”这个软件,把BCL文件转化成FASTQ序列语文件。以此,客户可以来验证,测序公司提供得数据就是否就是原始得,就是否就是真实得。再说一下最初生成得那个tiff文件。tiff文件实在太大了,所以,测序仪在测序过程中,只把tiff文件作为中间文件。最后就是把这个tiff文件删掉得。如果客户想要原始得图像文件,在HiSeqV4之前,可以让测序公司保留“、CIF”文件。CIF文件就是一种彩色图案得向量文件,它得优点就是比tiff文件得数据量小很多。测序公司把CIF文件给客户之后,客户就可以瞧到原始得图像文件了。但就是,请注意:在HiSeq升级到V4之后,保留CIF文件得这个选项就是被取消掉了。所以,对于要测V4Lane得客户来说,就是拿不到CIF文件了。接下来,我们讲一下碱基识别。我们之前讲:4种dNTP,各标一种荧光基团,红、黄、蓝、绿,四种颜色,根据颜色来判断碱基种类。这个实际上就是一种简化了得说法。实际情况,要比这个复杂得多。来瞧这个图,这就是2种荧素得荧光得波长图。我们会发觉,这两种荧光色,它发出来得发射光,它在波长上就是有交叠得。在X得这个位置,主要就是绿色荧光素得贡献,但就是蓝色荧光素,也有少许贡献。而在Y这个波长位置,蓝色荧光素就是做了主要贡献,但就是绿色荧光素,也有少量供献。在实际测序过程中,就是4种荧光素发出得亮,相互有交叠,相互之间得交系,变得更加复杂。那么,现在我们要做得事情,就是把A、C、G、T,4种荧光素得贡献给拆开。首先,我们就要确定4种荧光素在4个被测波长处得贡献率。我们可以瞧一下,这个表,就就是4种荧光素,在4个波长分别有不同得贡献率。这样就组成一个4X4得贡献率表格。我们在实际得分析当中,等于解一个4元1次、4联方程。因为就是4个未知数,又就是4个方程,所以肯定就是可以解出来得。说解方程,有点复杂。那么我们来打一个比方。让大家来理解这个事情。假设有一家饭店,它有4个熟客:甲、乙、丙、丁。它日常又提供4道菜:猪肉、白菜、黄瓜、花生。大厨知道:甲最爱吃猪肉、乙最爱吃白菜、丙最爱吃黄瓜、丁最爱吃花生,每个人来了饭店之后,主要吃自己最爱吃得,也会吃些别得菜,但别得菜都吃得不就是太多。那么这个大厨不到前台,瞧不到今天来得客人。如果,这个大厨想要知道今天来得客人就是谁,她有什么办法呢？瞧今天哪个菜被吃掉得最多。如果今天得菜被吃掉得最多得就是猪肉,那她可以大致地判断,今天就是甲来过了;如果她瞧到今天被吃掉得菜,最多得就是白菜,很可能就是乙来过了;那么其它得,道理也就是一样得。希望这个例子可以帮大家来理解一下,这4个荧光与4种碱基得判读得关系。接下来,我们再讲一下,Phasing与Prephasing。在Illumina得测序过程当中,一个簇,大概有5千个到1万个分子。但就是在边合成、边测序得过程当中,每一步酶反应,理想情况下,应该这5千个分子都延长1个碱基。但实际情况,总有少量分子没有完成延长反应。也就就是说,总有少量得分子会掉队,我们称这种掉队得现象叫“phasing”。Phasing主要就是由于酶活性不足,所引起得。如图所示,掉队得这个分子,它所发出得荧光信号,与大部队所发出得荧光信号就是不一样得。这个循环得次数越多,掉队得分子就越多。所以,测序越到后面,它Phasing得分子数就越多。最后,信号得可靠性就越差。除了掉队得分子,还会有一部分分子,会跑得超前,也就就是在一个循环中,它延长了2个碱基。在一个循环中延长了2个碱基得最主要得原因,就是dNTP上标记得那个叠氮基团(N3)掉了。我们知道,叠氮基团就是非常容易从有机化合物上掉落得。当叠氮基团掉落之后,dNTP得3’端得羟基就暴露出来了。当丢失了叠氮基团得dNTP加到(合成链得)3’端之后,它得聚合反应不会终止,而就是会继续往前走。当再加上了一个带叠氮基团得dNTP之后,这个聚合反应才停下来。这样得后果,就就是一个循环,某些分子,会合成了2个碱基。也就就是说比大部队多走了一步。那么这个多走了一步得碱基,它所发出来得荧光颜色,也就是与大部队不一样得。在Illumina测序过程当中,Phasing与Prephasing就是限制测长得最主要原因。也就就是说,随着循环不断进行,越来越多得分子掉队,还有越来越多得分子超前。然后,它们所产生得噪音,掩盖了大部队得信号得时侯,也就就是测序开始测不准得时侯。在HiSeq测序当中,从第12个循环开始,在计算某个光点就是哪种碱基得时侯,就要把Phasing与Prephasing得影响,纳入考虑。为了对光点当中荧光素得纯粹程度进行描述,Illumina公司定义了个标准,叫“chastity”,Chastity得定义,就就是浓度最高得那个荧光素得量,去除以“它自己+排名第二得荧光素得量得与”。大于0、6就是一个好碱基。用更加通俗得话来说,也就就是“老大”比“老二”,如果大于、等于“1、5倍”,这就就是个“好”碱基。如果“老大”比“老二”不足“1、5倍”,这就就是个“坏碱基”。Illumina对每个read得质量都要做一个检验,这个检验就叫“passfilter”检验。检验得标准,就是瞧前25个碱基当中,有几个就是“坏碱基”。如果只有一个、或者没有坏碱基,则Passfilter就通过;如果有超过一个以上得坏碱基,Passfilter就不能通过。那我们平时说,测序服务保证多少“PFdata”,指得就就是PassFilter(PF)得数据。PassFilter最主要得作用,就就是把那些一个光点当中,含了几个cluster得那些点,给去掉。只剩下那些纯粹得单克隆得read,作为合格得数据,提交给客户。我们平时说“PF率”,指得就就是PassFilter得Reads数,占总得、测到得Reads数得比例。PF率可以从一个侧面反映测序得质量。一般来说,如果上样密度过高,PF率就可能会下降。一个碱基得QualityScore,也就就是这个碱基得质量分数(Q值)。这个就是通过这个碱基被误判得可能性,换算出以10为底得对数,再乘以“-10”得到得这样一个数字。这个Q值,有点象我们说黄金得纯度,我们说“三九金”,或者说“四九金”,就就是指99、9%得纯度得金子,或者就是99、99%得纯度得金子。我们平时说Q30,就就是指一个碱基得可靠性达到99、9%。或者说,它得出错得可能性小于千分之一。同样道理,我们说Q40,就就是指一个碱基得可靠性就是99、99%。或者说,它得出错得可能性就是万分之一。那么,我们经常说Q30比例,所谓得“Q30比例”,就就是在全部PF数据当中,达到、或者超过Q30质量标准以上得数据,占所有PF数据得比例,叫Q30比例。Q30比例,可以表征一个测序过程得质量得好坏。一个碱基得质量分数,不就是以数字方式,直接记录到最后得Fastq文件得。而就是把它得Q值,加上33,再用ASCII码表转换成一个字母,把这个字母录入Fastq文件。这样做,有2个好处。如果我记2位数字,那么就占2个字节,现在用一个字母来记录,只占一个字节。那(数据存储)空间就节省了很多。第二个好处,用ASCII码字母表,一个碱基,只对应一个字母;如果就是用2位数字来记录,就有可能发生移码错误。而用ASCII码,一个字母来记录,就不太容易发生移码错误。在软件做完上述所有得数据处理之后,就会生成一个Fastq文件。Fastq文件里,主要包含了3部分内容。第一个部分,就是每个Read得目录信息。也就就是这个Read来自于哪台HiSeq、第几个run、第几个Lane、与第几个Tile,以及在这个Tile得X、Y得什么位置。接下来,就就是所测到得碱基得序列。最后,就是这些碱基序列对应得质量分数信息。这个,就就是Fastq文件。到Fastq文件之后,测序仪所要完成得工作,就完全完成了。Pacbio就是目前读长最长得测序技术公司。它得读长,最长可以达到2万到3万个碱基,平均可以达到8千多个碱基。相比于llumina与IonTorrent得几百个碱基得读长来说,有着明显得优势。PacBio得测序原理,与别得高通量测序得原理,基本上也就是一样得。也就是边合成,边测序。首先,这个聚合酶就是固定在测序小孔得玻璃底板上。这个聚合酶又与DNA模板、测序引物就是结合在一起得。然后加入带4色荧光得dNTP底物,这些dNTP都在其磷酸基团上被标上了荧光基团,四种碱基、各标一种颜色。当一种与聚合酶正要合成得碱基一致得dNTP被酶抓住得时候,酶就会长时间地抓住这个dNTP,不让这个dNTP漂走。这时侯,激发光从小孔得底部照进来,打在这个被抓住得dNTP上,就会在较长时间内发出荧光。仪器根据所拍到得荧光得颜色,就可以来判断,这个碱基就是哪种碱基。一个循环得聚合反应发生完毕之后,焦磷酸基团就从原来得dNTP上掉下来,因为荧光基团就是连到这个焦磷酸上得,所以这个荧光基团也就一起掉下来了,在溶液中就会漂走。接下来,进行第二、第三个循环……,一直进行下去。一张芯片上有几万个孔,同时进行测序,这样一次就可以得到几亿个碱基得序列。接下来,分几个要点,来说明这个测序得过程。与Illumina一样,PacBio也采用了4色荧光基团来标记dNTP,但就是PacBio得标记与Illumina得标记有所不同,PacBio得荧光基团直接就是标在dNTP得3'端得磷酸基团得末端得。这样标记得好处就是:当一个聚合反应得循环完成得时侯,dNTP上得那两个磷酸基团就掉下,连在这个磷酸基团上得荧光基团也随一块儿掉下来。它掉下来之后,就在溶液中漂走,不会影响接下来得测序过程了。然后,我们说一下这个测序小孔得设计。这个测序小孔叫ZeroModelWaveguide,简称ZMW。小孔得直径很小,光只能在小孔中传输很短得距离。这个特点对PacBio得测序很重要。因为酶就是被固定在玻璃底板上得,所以,只有互补得dNTP被酶抓到得时侯,这个dNTP才会较长时间地停留在离玻璃底板很近得位置。也只有这样,才会被激发光照到,并且发出它得荧光。PacBio得光学设计中,入射光就是几百纳米波长得可见光,光从小孔得底部得玻璃处照到小孔中来。这个,只有70纳米。其它游离得dNTP,只会非常短暂地进入小孔,又很快漂走。所以,这些游离dNTP带来得得噪音(信号),就被抑制在很低得水平。接下来,我们说一下PacBio得建库。PacBio得建库就是比较特别得。它得库就是在DNA片段得两段各接一下发夹型得接头。接好了发夹形得接头之后,形成得文库就是一个哑铃形得文库。这种哑铃形状得文库有个好处,那它整个分子实际上就是一个圆环。在测序得过程中它可以周而复始地进行测序,这对于发挥PacBio得长读长得优势就是很有益处得。接下来,我们说一下PacBio它测序长度优势得来源。这个来源,就是因为它测得就是个单个分子。相比之下,Illumina或者IonTorrent测得都就是一簇分子。或者说它们测得都就是一大堆分子。当它测一大堆分子得时侯,每个循环,多多少少,总有一些分子落后;也多多少少,有些分子超前。这些落后、或者超前得分子,在每个循环里面就会给出噪音。而且,随着循环次数越来越多,落后、与超前得分子也会越来越多,达到一定程度得时侯,噪音就会很大,大到会掩盖掉信号。当噪音大到掩盖掉信号得时侯,实际上测序就测不准了。相比之下,PacBio它只有一个分子,所以,它不存在同步问题。这就让它可以测到几千、基至上万个BP都可以达成。接下来,我们要说一下PacBio测序得缺点。最大得缺点就是对碱基得判读不准。它得错误率就是12、5%。也就就是说,它每读8个碱基,就有一个就是读错得。那么它主要得错误类型就是"插入"。也就就是说,它会多读一个碱基。好在,它得这种错误就是随机得。也就就是说,您在这个地方再读一遍,它不一定会发生同样得错误。那么,对于同一个序列,多测几遍之后,这些偶然误差,可以被校正过来。接下来,我们说一下限制PacBio读长得因素。第一个因素,就就是DNA链上出现了缺口。测序过程中就是用激光照射来发出荧光得,所以当强光长时间照射DNA链得时侯,DNA链就有可能被照断掉,出现缺口。当酶读到这个缺口得时侯,酶就从模板链上掉下来。这时侯,测序就终止了。这就是第一种可能。第二种可能,就是光线照射情况下,酶有可能会变性,当酶发生了变性之后,失去了聚合酶得功能,这时侯,测序也会终止。第三个限制因素,就是文库本身得长度。因为要做片段长度大于20~30K得文库,就是有相当大得困难得,所以,文库本身得质量,在一定程度上,也限制了PacBio得读长。在高通量测序当中,测序得通量,就是一个很重要得技术指标。那PacBio大根一张芯片一次可以测到0、3~0、4G得数据。在PacBio测序中,芯片上得小孔数就是第一个绝对得、限制性得因素。目前得芯片,就是有15万个小孔。但这15万个小孔