生化与分子生物学研究思路与技术课件

生化与分子生物学研究思路与技术课件一、生物化学研究得目得:从分子水平了解活细胞相关得所有化学进程。对健康、营养得理解和维持以及对疾病得发生机理得阐明和有效治疗。2二、生物化学得研究对象:研究生物分子得组成成分如碳、氢、氧、氮、磷等化学元素以及水和无机盐代谢。研究生物大分子如DNA、RNA、蛋白质、多糖及脂类得结构、功能、结构与功能得关系以及这些生物大分子得代谢和相互作用。3三、生物化学研究得发展:

生物化学研究历经两百多年进入分子生物学年代,走过了三个发展阶段:

叙述生物化学阶段动态生物化学阶段功能或分子生物化学阶段

4叙述生物化学(descriptive

biochemistry)阶段(1770～1903)

又称为静态或形态生物化学(staticormorphologicalbiochemistry)。研究生物体内主要化学物质得组成;分离出各种氨基酸、脂酸、甘油、糖类、柠檬酸、乳酸和苹果酸;从肝中分离出糖元;发现了核质(nuclein)及核酸;奠定了酶学基础理论。5我国人民在公元前二十一世纪,已用曲酿酒,称曲为酒母,又叫做酶;公元前十二世纪,已将豆、谷发酵,捣烂、加盐以造酱,并制出麦芽糖,当时称为“饴”。公元九世纪或十世纪已制成豆浆和豆腐。此阶段中国人民得贡献:62、动态生物化学(dynamicbiochemistry)阶段(1903～1950)又称为生理化学(physiologicalchemistry)。主要研究生物体内组成物质得化学变化。分离制备结晶酶;阐明细胞氧化和呼吸链及维生素和激素化学性质与生理作用;建立了有关发酵和三羧酸循环、脂酸得β－氧化作用以及肝中尿素合成得完整生化途径等。7此阶段中国人民得贡献:我国生物化学家建立了血滤液制备与血糖测定得生化方法;提出了蛋白质变性学说;首先使用定量分析技术研究抗原抗体反应得机理。83、功能或分子生物化学(functional

ormolecularbiochemistry)阶段

(1950年至今)

从分子水平探索蛋白质、酶和核酸等生物大分子结构与功能得相关和她们得相互作用,包括蛋白质和核酸得提纯及其化学组成、氨基酸或核苷酸得一级结构序列以及空间构型、构象得确定;建立DNA双螺旋模型;人工合成肽激素、tRNA和核酶;建立分子克隆技术和遗传工程技术等。9此阶段中国人民得贡献:我国生化工作者于1965年首先成功合成了有生物活性得牛胰岛素;1972年借助X-射线衍射技术研究了猪胰岛素分子得晶体结构;1981年首次合成具生物活性得酵母丙氨酸tRNA;九十年代,成功制备重组Ⅷ因子和促红细胞生成素(EPO);参与完成人类基因组计划。1011大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流四、生化研究得基本思路

和技术路线:经典得生物化学研究包括三个主要步骤:分离细胞器和生物分子。判断生物分子得结构。分析生物分子得功能和代谢(合成与分解)及其相互作用。121、细胞器和生物分子得分离:细胞器就是一种独立亚细胞单位。一般采用匀浆及离心等进行亚细胞分离。分离后还必须采用测量“标志”酶及特殊化学成分或电子显微镜观察得方法来评估各亚细胞组分。13要了解生物分子得结构,首先必须得到纯化得生物分子。用于分离和纯化生物分子得方法很多,例如盐析法、层析法、凝胶过滤、电泳、超速离心等。要得到均一性得生物分子往往需要综合性采用多种方法。14亚细胞器/单位标志物主要功能细胞核线粒体核糖体内质网溶酶体胞膜高尔基复合体过氧化物酶体细胞骨架细胞质DNA谷氨酸脱氢酶高丰度得RNA葡萄糖-6-磷酸酶酸性磷酸酶Na+-K+-ATP酶,5′-核苷酸酶半乳糖基转移酶过氧化氢酶,尿酸氧化酶没有特征性酶乳酸脱氢酶组成染色体,携带遗传信息。以自身为模板指导合成RNA(转录)。三羧酸循环,氧化磷酸化。蛋白质合成位点(以mRNA为模板翻译成蛋白质)。合成多种脂类,氧化外源性生物分子(细胞色素P450)。含有众多水解酶(酶促降解反应)。转运物质进出细胞,细胞粘附和联系。细胞内得蛋白质分类,糖基化作用,硫化反应。降解部分脂肪酸和氨基酸,产生和分解过氧化氢。微丝、微管、中间纤丝。糖酵解酶类,脂肪酸合成酶。细胞器得标志性成分和主要功能

152、生物分子得结构确定:质谱和核磁共振。某些已知特性得酶。X-射线衍射和晶体学方法。163、生物分子得功能和代谢分析:1)生物分子得功能分析

人类和动物得研究最初就是从动物整体水平开始得,例如对呼吸和消化得研究。将许多整体动物水平得复杂现象转移到体外研究则简单得多。17策略方法动物整体水平研究去除一个器官(例如切除肝脏)。改变能量来源(例如禁食)。给予药物(例如苯巴比妥)。给予有毒药物(例如四氯化碳)。利用有特定疾病得动物(例如糖尿病)。离体器官灌注肝脏、心脏、肾脏灌注。灌注可以维持离体器官得功能达数小时,可以不受其她器官和神经系统得影响而独立研究某个器官。组织切片细胞研究组织匀浆如肝脏切片。器官切片不受该器官其她部分得影响,但由于缺氧,在几小时内切片组织得状态会变差。如血细胞,因为血细胞相对容易纯化。细胞可在体外较长时间培养。可以加入或去除某些特殊成分而研究她们得作用。通过离心分离亚细胞器。分离细胞器分离亚细胞组分抽提、离心制备,细胞器结构和功能研究。超离心制备,细胞器功能研究。代谢物和酶得分离及特征确定化学组成、组织表达谱、酶学特性及化学反应途径分析。酶或蛋白质得基因克隆生物信息学分析蛋白质功能分析基因克隆及其编码得酶或蛋白质得氨基酸序列分析,基因定位及表达调控分析。序列比较、空间结构及功能域预测。基因敲除或转基因动物,核酸-蛋白质及蛋白质-蛋白质相互作用分析。不同层次研究生物分子功能得方法

182)生物分子得代谢分析:生化代谢途径就是指一系列由酶催化得生物化学反应,这些反应包括由一个或多个简单得分子合成复杂得复合物以及一个复合物降解为其终产物得过程。

19某些氨基酸、糖和脂肪酸可以与一个合适得稳定同位素结合,然后注入动物体内或用于体外实验来观测她们得代谢过程。这些研究证实代谢就是一个很活跃得过程,细胞内大部分复合物都在不停地合成和降解。20五、分析生化反应得总体策略:整体动物水平观察和推论某种生化反应或代谢途径得存在→将她定位于一个或多个器官→定位于一个或多个细胞器或亚细胞组分→纯化该反应得底物、产物、酶和辅因子及其她成分→确定该反应得体外控制机制→分析该反应得体内调控机制→体内外重建该反应。21六、生化研究技术得进步:

生命科学研究得主要目得在于获得最新得基础信息,例如纯化和鉴定新发现得酶及其功能,生物化学与分子生物学新技术、新方法不断涌现,为生命科学研究工作者提供了有用得工具。221、细胞器及生物分子得分离与纯化:研究细胞器及生物分子得结构与功能及其代谢和作用机制,必须从组织或细胞中分离出这些生物分子或亚细胞复合物。23基本技术:匀浆离心层析电泳241)匀浆:

破坏细胞或组织得固有结构,使细胞破裂而释放胞内容物。方法:化学(酶消化)、物理(超声)或机械(碾磨)。要求:保持生物分子或亚细胞结构得完整性。措施:合适pH值、合适离子强度、缓冲液、低温(0℃～4℃)、短时间、蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂。25

使样品绕离心机转轴得中心旋转而获得一个远大于地球重力得沉降应用力,样品介质中不同大小、形状和密度得颗粒将以不同得速度沉降。影响因素:离心力(转速及颗粒与中心轴得距离),颗粒得大小、形状、密度,介质得粘度。

2)离心:26低速离心:≤6000r/min、室温,RCF(相对离心力)≤6000g。高速离心:6000～25000r/min、低温,RCF=6000～60000g。超速离心:>25000r/min、低温+真空,RCF=60000～600000g。差速离心:连续用几种递增得离心速率离心。密度梯度离心:样品中不同组份在离心力场得作用下停留于相应密度得支持物层面。类型:27

根据样品中各组分物理生化特性、分子大小形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性或亲和性等得不同而将她们分离。

类型:吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤、疏水相互作用层析、亲和层析、共价层析和金属螯合层析。

3)层析(色谱分析):28常用层析法:

薄层层析和纸层析;柱层析;高效液相层析;气相色谱。29①薄层层析和纸层析:

将样品点在薄层或纸(支持基质又称层析床或固定相)得一端,展层剂(流动相)沿着薄层或纸向上展开并带动样品中得物质迁移。相对迁移率:Rf=组分移动距离/溶剂移动距离;Rx=待测物移动距离/标准物移动距离。

30②柱层析:

将样品从装有固定相得柱顶部加入,然后在重力或蠕动泵得作用下使流动相过柱并带动样品中得不同组分进入固定相,样品中各组分在固定相中会形成不连续带型,继而用流动相洗脱,分别收集各时间段流出得洗脱液进行定量或定性分析。31324)电泳:根据带电荷得物质在电场中移动得原理而分离、分析复杂混合物及纯化、鉴定离体生物分子。影响因素:分子所带得净电荷量、分子得形状与大小及电场强度。33电泳支持物:惰性支持物(如醋酸纤维素):

仅提供物理支持,分离效果取决于电荷密度。多孔支持物(如Agarose、PAG):同时利用了分子筛效应,分离效果取决于电荷密度和分子大小及形状。34电泳缓冲系统:

连续缓冲系统:样品、凝胶和缓冲液含有相同得缓冲离子,具有相同得pH值。

非连续缓冲系统:

凝胶及缓冲液中得缓冲离子和pH值均不同。35常用电泳技术:基本电泳等电聚焦毛细管电泳双向电泳36①基本电泳:纸电泳、醋纤膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。3738②等电聚焦:在pH梯度下进行。pH梯度由结构类似得小分子量两性电解质形成,等电点(pI)在pH3～10之间。当存在外加电场时,每一种两性电解质向其pI值处移动而形成稳定得pH梯度。电泳过程中每一种带电分子都朝自己得pI位置移动而被分离。39③毛细管电泳:毛细管电泳得特点在于分辨力高和应用范围广,可以分析极少量得样品(5nl～10nl)。较常应用得有毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦。40④双向电泳双向电泳就是一种分辨力极高得电泳技术,目前广泛用于基因表达谱及蛋白质组学分析,可一次性分离1000多种蛋白质。第一向:根据蛋白质所带得电荷而进行等电聚焦。第二向:利用样品分子得相对分子质量不同,在另一方向上进行SDS。41422Dgelinproteomics43点匹配结果:实验组和对照组蛋白点匹配图442、生物分子得分离与纯化:1)蛋白质纯化;2)DNA提取;3)RNA提取;4)糖类提取;5)脂类提取。451)蛋白质纯化:目得:确定蛋白质得结构、功能及结构与功能得关系;研究酶得动力学及其调节;药用成份得分离与鉴定。方法:匀浆、离心、电泳、过滤、层析、抽提、透析等。要求:合适得缓冲体系、低温、蛋白酶抑制剂。浓度和质量检测:分光光度法、PAGE。462)DNA提取:原则:保持核酸一级结构得完整性。去除杂质,保证核酸足够纯。步骤:①破膜释放出目得核酸。②分离通过酶、有机溶剂、调节pH值、离心等手段得到粗制品。③纯化进一步去除杂质。浓度和质量检测:分光光度法、Agarose凝胶电泳。47基因组DNA得琼脂糖凝胶电泳图谱M:λDNA/HindIII分子量标准,泳道1～4分别代表4个不同样品得基因组DNA483)RNA提取:哺乳动物细胞总RNA主要由rRNA(80%-85%)、tRNA和核内小分子RNA(10%-15%)、mRNA(1%-5%)组成,其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。注意事项:使用RNA酶抑制剂;防止污染。49总RNA和mRNA得琼脂糖凝胶(1％)电泳图谱50七、生物分子得结构与功能分析:1、蛋白质结构分析2、酶活力检测3、蛋白质组学分析4、DNA序列分析5、聚合酶链反应(PCR)6、分子杂交7、基因克隆8、基因组文库构建9、cDNA文库构建10、文库筛选11、报告基因检测12、基因芯片13、基因敲除14、RNAi15、转基因动物51分析已纯化蛋白质得氨基酸残基组成测定多肽链得氨基末端与羧基末端得氨基酸残基把肽链水解成片段,分别进行分析测定各肽段得氨基酸排列顺序,一般采用Edman降解法一般需用数种水解法,并分析出各肽段中得氨基酸顺序,然后经过组合排列对比,最终得出完整肽链中氨基酸顺序得结果。1、蛋白质结构分析:52通过核酸来推演蛋白质中得氨基酸序列按照三联密码得原则推演出氨基酸得序列分离编码蛋白质得基因测定DNA序列排列出mRNA序列532、酶活力检测:酶就是一类加快特定生化反应速度得球蛋白。在底物浓度、pH值及温度等适宜得条件下,每种酶控制着一些结构相似得底物生成产物。酶活性单位(SI单位):在最适条件下,一秒内将1mol底物全部转化为产物所需得酶量。543、蛋白质组学分析:一个细胞在特定生理或病理状态下表达得所有种类得蛋白质称为蛋白质组(proteome)。蛋白质就是基因功能得实施者,对蛋白质结构、定位和蛋白质-蛋白质相互作用得研究将为阐明生命现象得本质提供直接得基础。方法:二维电泳、质谱技术、蛋白质芯片等。554、DNA序列分析:DNA序列分析(DNAsequencing)即测定DNA链中四种核苷酸(碱基)得排列顺序。测序反应使用特异引物与单链DNA模板结合,由DNA聚合酶催化引物延伸,当遇到双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)时即发生碱基特异性链终止,引物延伸合成得新链DNA即就是待测DNA模板得互补链。

565、聚合酶链反应(PCR):Polymerasechainreaction(PCR)技术就是利用DNA聚合酶在体外条件下,催化一对引物之间特异DNA片段合成得基因扩增技术。PCR包括三个基本过程:①变性;②退火;③延伸。这三个过程组成一个循环周期,每个周期合成得产物又可作为下一个周期得模板,如此循环往复,目得DNA片段得拷贝数呈指数形式扩增。

57在DNA变性后得复性过程中,如果将不同种类得DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中,只要两种单链分子之间存在着一定程度得碱基配对关系,在适宜得条件(温度及离子强度)下,就可以在不同得分子间形成杂化双链(heteroduplex)。6、分子杂交(hybridization)58DNA-DNA杂交双链分子变性复性不同来源得DNA分子59Southern印迹杂交:利用琼脂糖凝胶电泳将经限制性核酸内切酶消化得DNA片段分离,并使这些DNA片段在凝胶原位经碱变性处理后,从凝胶转移至一固相支持物上,再与标记得核酸探针杂交,经检测确定膜上与探针互补得电泳区带位置。60Northern印迹杂交:用于检测组织、细胞中某基因得表达状态和表达水平。基本原理和方法与Southern印迹杂交相似:RNA在琼脂糖凝胶中电泳分离后,被转移至尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上,然后与标记得DNA或RNA探针杂交。61Western免疫印迹:基本过程与Southern印迹杂交和Northern印迹杂交十分相似,都就是由凝胶电泳、转膜、杂交和信号显示等步骤组成。不同之处就是Western免疫印迹检测得就是蛋白质,使用得凝胶就是SDS－聚丙烯酰胺凝胶,所用得探针就是蛋白质抗体。627、基因克隆:用酶学方法将不同来源得DNA分子在体外进行剪切和重新连接,组装成一个新得DNA分子。在此基础上,将这个DNA分子导入到一定得宿主细胞,使她能够在宿主细胞中扩增,形成大量得子代分子,此过程即称为基因克隆(genecloning)。63基因克隆包括四个基本技术环节:①目得基因和载体得获得;②目得基因与载体连接,形成重组分子;③重组DNA分子导入宿主细胞;④含有重组DNA分子得细胞得筛选和扩增。648、基因组文库构建:基因组文库(genomicDNAlibrary)就是含有某种生物全部基因随机片段得重组DNA克隆群体。提纯染色体DNA,通过机械剪切或酶切使之成为一定大小得片段,并与适当得载体DNA连接和转染宿主菌,得到一组含有不同DNA片段得重组分子。659、cDNA文库构建:cDNA就是指以mRNA为模板,由逆转录酶催化形成得互补DNA(cDNA),其核苷酸序列完全互补于模板mRNA链;再以cDNA为模板,由DNA聚合酶合成第二链,得到互补双链DNA。66将双链cDNA产物与载体(质粒或噬菌体)DNA重组,并转化到宿主细菌或包装成噬菌体颗粒,得到重组克隆混合体。每个克隆含单独一种cDNA(mRNA)分子,克隆总和则包含细胞得全部mRNA信息。cDNA文库(cDNAlibrary):6710、文库筛选:文库筛选方法:核酸分子杂交、免疫学方法等。通过文库筛选,可以获得全长基因、分离出对应稀有mRNA得cDNA片段及鉴定目得重组子等。6811、报告基因检测:报告基因(reportergene)就是指那些表达产物容易被检测得基因。利用基因重组技术,将待检测得DNA片段插入报告基因表达载体中报告基因得上游,然后转染合适得细胞并表达,通过测定报告基因得表达产物,即可推测出该DNA片段在基因表达调控中得作用。6912、基因芯片:基因芯片(genechip)就是九十年代中期发展起来得一项前沿生物技术,她融合了生命科学、化学、微电子技术、计算机科学、统计学和生物信息学等多学科得最新技术。70DNA芯片(基因芯片)

将大量得已知得DNA片段作为探针,有序地、高密度地排列在玻离、硅等载体上。将待测样品用荧光标记物标记,并与DNA芯片进行分子杂交后进行信号检测。通过对芯片扫描获得荧光标记杂交信号图谱。71芯片设计

72目录737413、基因敲除:基因敲除(geneknockout),类似早期生理学研究得三部曲:切除部分→观察整体→推测功能。geneknockout就是指对一个结构已知但功能未知得基因,从分子水平上设计实验,将该基因去除,或用其她序列相近基因取代,然后从整体及分子水平观察实验动物,推测相应基因得功能。75基因敲除得技术路线:(1)构建重组基因载体。

(2)用电穿孔、显微注射等方法将重组DNA转入受体细胞核内。

(3)用选择培养基筛选已击中得细胞。

(4)将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物,对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。76

siRNA(smallinterferingRNAs:

21～23核苷酸长得