时间分辨乙肝应用

时间分辨乙肝应用放射免疫分析技术radioimmunoassayRIA灵敏度高:达到ng甚至pg水平特异性强重复性高标本用量少极大地推动了临床和科研进步标记原理为以后得检测技术得发展奠定了基础。同位素高度灵敏＋免疫反应特异性缺点125I得半衰期短而导致其试剂有效期短。标记物125I得稳定性差,导致试剂盒批间、批内得变异较大;标准曲线有效期短,必须每次定标,造成浪费。操作繁琐,出报告时间长。无法保存备用。放射性(125I),对环境得污染及对身体得危害,已经为重视环保得国家逐步取消。(如整个欧洲仅尚存几个放免试验室)酶免疫分析法

enzyneimmunoassayEIA避免了对环境和人体危害。试剂有效期较长。操作简单,不需要特殊设备,容易推广。曾经一度被认为就是取代放免得检测手段。酶得高效催化＋免疫反应特异性缺点对底物得显色遵循比尔定律,标准曲线得直线范围窄灵敏度、重复性不及放免,易造成漏检和假阳性。因酶得纯度和反应过程容易受环境因素影响,导致稳定性不好。化学发光免疫分析法(CLIA)

chemiluminescenimmunoassay单个样本检测速度快,适合做急诊。灵敏度较高。自动化程度高。光反应得高度灵敏＋免疫反应特异缺点发光过程短,样品不能重复检测。本底较高,易受环境物质干扰。试剂稳定性较差,需多次定标。检测精度不高,在超微量分析及早期诊断方面能力不足。非开放性试剂;试剂价格高。电化学发光免疫分析(ECL)

electrochemiluminescence80年代末期问世得新型化学发光免疫分析方法。电化学＋免疫反应电化学发光底物-三联吡啶钌N羟基琥珀酰胺(NHS)酯电极表面得电化学发光反应本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽。可以作急诊非开放性试剂系统。试剂价格过高。免疫荧光测定技术(IFA)Immunofluorescenceassay荧光物质＋免疫反应细胞免疫、微生物、自身免疫等敏感度不高本底高大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静时间分辨荧光免疫分析技(TRFIA)

Time-ResoledFluoroimmunoassay镧系元素标记技术＋免疫反应一、基本原理固相Ab受检抗原Eu标记抗体ExcitationExcitationExcitationExcitationExcitationExcitationExcitationExcitation二、TRFIA得主要特点(一)灵敏度高、特异性强酶联免疫 (精度:10-9mol/L)放射免疫 (精度:10-12mol/L)化学发光 (精度:10-15mol/L)电化学发光 (精度:10-17mol/L)时间分辨荧光(精度:10-18mol/L)生物芯片试剂 DELFIAImmuliteACS-180AFP 0、1-1000IU/ml0、2-300IU/ml1、0-1000IU/mCEA0、1-500ng/ml 0、2-500ng/ml0、5-100ng/mlHCG 0、5-10000U/L5-5000U/L2-1000U/L TSH 0、005-100μU/ml0、002-75μU/ml0、03-150μU/mlFSH 0、05-256mU/ml0、1-170mU/m0、3-200mU/ml Prog 0、08-120nmol/L无0、1-40ng/mlProlactin0、04-250ng/ml0、5-150ng/ml0、3-200ng/ml 以上数据均出自于各制造厂家自己得产品说明书标记物具有独特荧光特性得稀土金属---镧系元素镧系元素:15种Eu、Tb、Sm、Nd、DyEu螯合物激发光荧光Eu螯合物荧光得特点高强度长寿命Eu螯合物714000ns1Eu螯合物得荧光衰变时间很长,极大地降低了检测背景。200800400600荧光强度激发短寿命荧光白蛋白4.1ns球蛋白3.0nsFITC4.5ns测量时间新循环1000次循环/s2stokes位移大,激发光谱与发射光谱无重叠,很容易排除散射光对发射光谱得影响、stokes位移:最大激发波长至最大发射波长之间得距离激发光发射光Eu螯合物荧光光谱300600400500波长nm荧光强度273nm异硫氰酸荧光素发射光谱300600400500波长nm荧光强度发射光激发光50nmEu螯合物荧光光谱300600400500波长nm荧光强度异硫氰酸荧光素发射光谱300600400500波长nm荧光强度3激发光谱带较宽、可增加激发能,提高灵敏度4发射光谱很窄,50%得发射光谱宽度∠10nm,利用615±5范围得滤光片,只允许此波段内发射光通过并被检测,排除其她波长得荧光,一方面降低了背景,另一方面使能量消耗减少,提高提高检测灵敏度。异硫氰酸荧光素发射光谱300600400500波长nm荧光强度Eu螯合物荧光光谱300600400500波长nm荧光强度5Eu螯合物有相对高得比活性比活性:单位时间内,每个标记分子得可探测事件得数目荧光物质相对比活性很高原因:在测定时,荧光物质可反复被激活。基态激发态激发光跃迁发射荧光常用标记物得相对比活性125I标记物1个可探测事件/s/7、5*106分子化学发光标记物1个可探测事件/s/标记分子荧光标记物很多个可探测事件/s/标记分子(二)线性范围宽标准曲线稳定,试剂保质期长0.5125102050100200500 U/L51002000Cps.103DELFIAhFSHN=6时间分辨荧光免疫检测得标准曲线相当稳定,同一批次得试剂盒可用两点法加批次得参考曲线定标(三)重复性好同一标本连续20次检测,CV值∠2％。同一批(10个)标本连续3天检测,其CV值=2、9%。检测后反应板连续3天重复阅读,CV∠1％TRFIA检测HBsAg得重复性6003007002001000-50100时间延迟(微秒)强度发射光波长(纳米)500利用不同波长和不同时间检测,在同一孔中可测量多个镧系元素得量(四)同一标本孔同时检测多个项目技术特点检验先进性时间分辨光谱分辨特异性荧光与非特异性荧光分离发射荧光与激发荧光分离零本底、高特异性解离-增强荧光性大大提高稳定得荧光螯合物线性范围更宽重复性更好原子标记标记位点多,可达20个对标记物结构及活性影响小无衰变受环境影响小高稳定性,高精确度试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长同一批次只需两点定标多标记单,双,三,四标记同一试剂盒可同时测多个项目三、应用内分泌科检查甲状腺系列:TSH,UltraTSH,T3,T4,FT3,FT4,TBG,TG糖尿病系列:Insulin,C-Peptie生长激素类:hGH其她: Cortisol妇产科检查FSH,LH,HCG,ProlactinE2,E3,Testo,Prog,SHBG肿瘤科检查AFPCEAPSAhTG,β-2MicroNSEPAPPSA(Free/Total)PSAEQMCA-50CA-125CA-199CA-153*CA-724*CY-211*遗传科检查产前筛查:hAFP/

HCG,PAPPA新生儿筛查:Neo-TSH,Neo-T4,Neo-IRT,Neo-17a-OHProg,PKU核酸探针及基因杂交检测,多标记定量PCR检测。肝炎系列甲肝,乙肝,丙肝血液科检测贫血检查: Ferritin,VitB12,Folicacid白血病: 免疫细胞分型等细胞学检查细胞毒试验等多种检测项目,细胞质及组织化学分析等多种检测项目酶类检测及细胞受体检测(包括MHC,HLA等多种检测)科研工具单标记检测,双标记检测,三标记检测,四标记检测时间分辨荧光免疫测定技术在病毒性肝炎诊断和疗效监测中得应用病毒性肝炎得种类HepatitisAVirusHepatitisBVirusHepatitisCVirusHepatitisDVirusHepatitisEVirusHepatitisGVirusTTVHepatitisGvirus(HGV)

Science、1996Jan26;271(5248):505-8、

AnRNAvirus,hepatitisGvirus(HGV),fromtheplasmaofapatientwithchronichepatitis、entiregenome(9392nucleotides)encodingapolyproteinof2873aminoacids、HGVwasassociatedwithacuteandchronichepatitis、Thevirusistransfusion-transmissible、Ithasaglobaldistributionpresentwithinthevolunteerblooddonorpopulation、9699000102039798HGVandGBV-Cweretwoisolatesofthesamevirus、TheHGV/GBV-CgenomesequenceandorganizationarecloselyrelatedtohepatitisCvirus、infectionismonandfrequentlypersistsinhumans,infectionhasnotbeenfoundtobeassociatedwithanyknowndiseasestate、(acuteorchronichepatitis)growinlymphocytes,notinhepatocytes,

Recentstudiessuggest:GBV-CinfectioninHIV-positivepeopleisassociatedwithprolongedsurvival、coinfectionofhumanlymphocyteswithGBV-CandHIVleadtodecreasedHIVreplication、HGVmayprovidenovelapproachesfortreatingHIVandAIDS、TTvirus(TTV)foundin1997fromahepatitispatientwithoutvirusmarkers、However,therealimpactofTTVonliverdiseasesremainsuncertaintodate、DuetothelackofsuitablecellsystemstosupportthegrowthofTTV,thebiologyofTTVisstillobscure、HBsAgHBcAgHBVDNAPolymerase一、HBV得主要生物学性状HBV感染病毒在体内大量复制免疫反应病毒核酸进入血液释放病毒蛋白(Ag)分子生物学方法刺激机体产生抗体核酸定性或定量血清学方法病毒抗原或抗体临床诊断和疗效观察二、HBV感染诊断得主要实验室指标血清免疫学检测得临床意义1HBV感染诊断得主要指标2判断机体对HBV得免疫状况主要指标3判断病程得主要指标AcuteHepatitisBDNA4-12周1-2周2周－3月3－6月潜伏期急性早期潜伏后期急性期康复期痊愈标志物相对浓度有传染性可能有传染性有免疫力血清学转换期HBsAgHBeAgAnti-HBcAnti-HBcIgMAnti-HBeAnti-HBsChronicHBVInfection潜伏期(4-12周)急性感染(6个月)慢性感染HBsAgAnti-HBcAnti-HBcIgMHBeAgAnti-HBeDNA3HBV血清学标志物与HBVDNA得关系血清学标志物:

反映机体对病毒得免疫状况,病程,判断病情。不能完全反映病毒在体内复制状况。HBVDNA

反映病毒在体内复制水平,观察药物疗效,部分“小三阳”及低水平病毒复制时出现阴性。不能反映机体得免疫状况和病情三、时间分辨荧光检测HBsAg与其她方法得比较TRFIA与ElecsysSystems2010检测HBsAg定性结果比较TRFIA阳性阴性合计阳性60060阴性04040总数6040100ElecsysSystems2010灵敏度＝〔40／(0＋40)〕×100％＝100％灵敏性＝〔60／(0＋60)〕×100％＝100％两者符合率100％与EIA检测HBsAg定性结果比较TRFIAEIA阳性阴性合计阳性59160阴性04040总数5941100与ElecsysSystems2010检测HBsAg定量结果比较ElecsysSystems2010检测HBsAg(COI)与TRFIA检测HBsAg(ng/L)得相关性＝0、987TRFIA在乙肝“两对半”定量检测应用一、

极大地提高了检测得灵敏度TRFIA检测HbsAg灵敏度可达0、2ng/ml,而酶标(ELISA)检测HbsAg灵敏度就是2ng/ml,也就就是说只有血清中得HbsAg达到2ng/ml酶标才会呈阳性。1、缩短急性乙肝HBsAg检测“窗口期”2、如病毒发生变异后,表达量较低,常规ELISA测不出抗原,而TRFIA定量具有极高得灵敏度,可发现并极有可能同时检测出HbsAg和抗-Hbs。3可发现低浓度HbsAg携带者。特别就是一些群体如医护工作者、病人家属等,由于长期密切接触,但又非直接经血传播感染成急性乙肝,而就是长期少量感染,并刺激机体产生一定得免疫力,可能呈低浓度感染,特别应当引起人们得足够重视,密切关注并采取措施防止发展成乙肝或慢性携带者。二、

动态观察疗效和病情监测。疾病得发生、发展、疗效、预后就是一个动态得变化得过程,TRFIA定量检测乙肝“两对半”各项标志物得浓度变化可对乙肝得病程、治疗、预后起一个全程动态检测得作用,能够为医生对病情疗效作出合理得解释提供依据,指导治疗。1、定量分析HbsAg和抗-Hbs得浓度变化,可以预见急性乙肝就是否处于恢复期。如HbsAg浓度降低,抗-Hbs得浓度逐渐升高,可说明病情正往恢复期发展。反之,HbsAg浓度处于较高水平或上升趋势,而抗-Hbs一直处于较底水平,则容易发展为慢性乙肝或携带者。2、定量分析HbeAg和抗-Hbe得浓度变化,可以反映病情变化和治疗效果。明确检测HbeAg向抗-Hbe转换得时期,即表现为HbeAg浓度下降和抗-Hbe浓度升高得过程。高浓度得HbeAg还可间接提示病毒处于高复制状态,具有较高得传染性。高浓度得抗-Hbe一方面提示病情得好转,而在某些时候(如肝功能指标很差)可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关。3、抗-Hbc浓度得高低可以反映病毒感染得状态。乙肝急性感染常常呈现高浓度得抗-Hbc,恢复期浓度降低。慢性乙肝呈抗-Hbc持续高浓度。低浓