蛋白质组学相关概念与技术及其研究进展

蛋白质组学相关概念与技术及其研究进展蛋白质组学相关概念与技术及其研究进展/蛋白质组学相关概念与技术及其研究进展蛋白质组学相关概念与技术与其研究进展摘要:随着后基因组时代的到来，蛋白质组学得到了空前的发展。包括蛋白质组、蛋白质组学、功能蛋白质组学和结构基因组学等新的概念和学科不断涌现，并相应改进和发展了许多新的技术和研究手段，如双向凝胶电泳、生物质谱、生物传感芯片质谱、蛋白质芯片、和生物信息学等。关键词:后基因组时代；蛋白质组；蛋白质组学；研究技术；发展趋势；展望21世纪将是生命科学的世纪。继2000年6月26日人类基因组工作框架图绘制完成后，参与人类基因组计划的美、日、法、德、英、中等六国科学家和美国塞莱拉公司于2001年2月12日联合向世人正式公布了人类基因组图谱与初步分析结果。这是生命科学史上的一次新飞跃，标志着后基因组时代的来临。后基因组时代中，生命科学的中心任务则是阐明基因组所表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能，即生命科学的研究重心将从基因组学转移到蛋白质组学。1蛋白质组学相关的核心概念1.1基因组和蛋白质组蛋白质组这一概念是由澳大利亚学者Wilkins和Williams等人于1994年提出，并首次公开发表在1995年7月的Electrophoresis杂志上，指的是由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质。蛋白质组与基因组相对应，也是一个整体的概念，是基因组表达的全部蛋白。但两者又有根本的不同之处。基因组是静态的，一个有机体从它的发生、发展到衰老、死亡，不同细胞、组织和器官的基因组是基本稳定不变的。但基因组内各个基因表达的条件和表达的程度则随时间、地点和环境条件而不同，因而它们表达的模式，即表达产物的种类和数量随时间、地点和环境条件也是不同的。所以，蛋白质组是一个动态的概念。它不仅在同一个有机体的不同组织和不同细胞中不同；在同一机体的不同发育阶段，直至最后消亡的全过程中也在不断变化；机体处于不同生理状态下不同；在不同外界环境下也不同。实际研究中能够取得的蛋白质组分子实体通常只是总蛋白质组的一部分。可见既是整体又是动态的蛋白质组的研究任务有多么繁重了。1.2蛋白质组学和功能蛋白质组学随着蛋白质组的提出，蛋白质组学也自然而然地孕育产生。但目前,蛋白质组学仍无明确的定义，一般认为它是研究蛋白质组或应用大规模蛋白质分离和识别技术研究蛋白质组的一门学科，是对基因组所表达的整套蛋白质的分析。现阶段，蛋白质组学研究的内容不仅包括对各种蛋白质的识别和定量化，还包括确定它们的细胞内外的定位、修饰、相互反应、活性，和最终确定它们的功能。并对由此获取的数据进行数据库构建，以与不可或缺的推动这一学科进步的蛋白质组分析技术研究。由于对全部蛋白质的研究是非常困难的，所以中国的科学工作者提出了一种全新的研究策略：功能蛋白质组学。它是位于对个别蛋白质的传统蛋白质研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组研究之间的层次，研究特定时间、特定环境和试验条件下基因组所表达的蛋白质。1.3结构基因组学蛋白质的功能主要决定于它们的三维结构，因此，认识蛋白质的空间结构将成为生命科学中最关键最具有挑战性的前沿领域之一，于是促使了结构基因组学的兴起与蓬勃发展。结构基因组学的概念是1998年在美国Aegonne召开的第一届结构基因组学研讨会上提出的。2000年4月第一届国际结构基因组会议在英国Hinxton召开，正式定义结构基因组学为：在原子水平上阐明生物体的所有生物大分子的结构特性。即用基因组信息作为起始材料，在整个蛋白质组范围内来大规模研究蛋白质结构，其主要目标是利用基因获得其所有编码蛋白质的结构与功能，从而获得对有机体生命活动的全景式认识。2蛋白质组学研究技术蛋白质组研究主要包括样品或组织中的蛋白质分离和分离蛋白质的鉴定两个关键步骤。最初的主要研究技术仅仅是用于蛋白质分离和鉴定的二维凝胶电泳和质谱。但是，近几年这个领域的急剧发展受到了多种力量的驱动,在原有技术的基础上改进和衍生出许多新的技术。2.1蛋白质组研究的核心—用于分离的双向电泳(Two—dimensionalElectrophoresis)目前已具有26年历史的双向凝胶电泳仍是蛋白质组学研究的核心技术。其基本原理：第一项基于蛋白质的等电点不同在pH梯度胶内等电聚焦；第二项则根据分子量的不同大小进行SDS分离，把复杂蛋白质混合物中的蛋白质在二维平面上分开。根据第一项等电聚焦条件和方式的不同，可将双向电泳分为三种系统。第一种是在聚丙烯酰胺管中进行,载体两性电解质在外加电场作用下形成梯度，这一系统被称为ISO-DALT。它的最大缺点是不稳定，易发生阴极漂移。第二种系统称为IPG-DALT，主要是采用丙烯酰胺和不同的pH值的固定化电解质共聚所形成的具有pH梯度的IPG胶。第三种系统是非平衡pH梯度电泳,，常常被用来分离碱性蛋白质。蛋白质被分离以后用考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色或放射性标记等方法显示。其中银染方法非常灵敏,蛋白质分辨率可以达ng级。由于双向电泳利用了蛋白质两个彼此不相关的重要性质分离，其分辨率非常高。一般一块蛋白质双向电泳凝胶能分离到1000-3000个蛋白质样点,最好的胶可以分离得到10000个以上蛋白质样点。并且不同实验室之间的实验结果已经能够相互比较。2.2生物质谱技术(MassSpectrometry)双向电泳分离到的蛋白质往往是数目多、量少。生物质谱技术以其极高的灵敏度和对结果迅速的获得使它正成为蛋白质鉴定分析的主要支撑技术，它是把样品分子离子化后，根据不同离子间的荷质比(m/z)的差异来分离并确定相对分子量。应用生物质谱技术鉴定蛋白质主要是根据蛋白质酶解后的肽质量指纹谱和肽序列信息去搜索蛋白质或核酸序列库。电泳分离后凝胶上的蛋白质,需先用适当的蛋白内切酶切成肤段，再用质谱鉴定。凝胶内切酶灵敏度高，是当前广泛采用的样品制备方法。最常用的蛋白内切酶是胰蛋白酶，它在蛋白质主链上精氨酸和赖氨酸残基的C端进行切割，灵敏度可达125fmol，而印记方法仅为0.5pmol。2.2.1肽质量指纹谱蛋白质直接从双向电泳凝胶上切下或印迹到PVDF膜上并切下，经过原位酶解得到酶解肽段，然后用质谱得到这些肽段的精确质量，即获得了肽质量指纹谱。由于每种蛋白质氨基酸序列都不同，当蛋白质被酶解后，产生的肽片段序列也不同，其肽混合物质量数即具一定特征性。用实测的肽段质量去查找蛋白质和核酸序列库,结合适当的计算机算法，可鉴定蛋白质。此外，根据肽段质量数变化，可对基因产生的插入、缺失、突变进行对比分析。当前，蛋白质的肽质量指纹谱测定常用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术。精度可达0.1个质量单位，灵敏度可以达到分解亚皮摩尔量的蛋白质,并且分析时间短，只需几分钟。2.2.2质谱测肽序列信息鉴定蛋白质肽序列信息一般用串联质谱测得。液相分离的肽段经在线连接的电喷雾质谱仪检测，质谱仪可选取肽段母离子并打碎并行成碎片离子，质量分析器测得碎片离子的质量，即得MS/MS质谱图，根据MS/MS图谱中不同碎片的质量差，可推测被测肽段的序列。然后利用一些相应的软件去序列信息库查找并鉴定蛋白质。2.3生物传感芯片质谱MALDI—TOF—MS是上个世纪八十年代末发展起来并经过不断改进的一种先进的离子化质谱技术。它通过肽质量指纹谱结合数据库搜寻以分析蛋白质序列而进行蛋白质鉴定。但是它在蛋白质之间相互作用与结构与功能的相互关系分析方面显得无能为力。而随之利用生物传感技术发展起来的生物分子相互作用分析技术是进行蛋白质相互作用分析的较好技术。将两者有机结合起来便形成了生物传感芯片质谱。它的核心是一块小的生物传感芯片，由金黄色的玻璃底物构成，此芯片在BIA和MALPI-TOF-MS中均可发挥作用。在BIA中，所需分析的可溶性蛋白质各自与结合在芯片表面的固定生物分子(受体)相互作用。滞留在芯片上的蛋白质通过与基质结合而从与受体分子的相互作用中解离出来，便可直接进行MALDI-TOF-MS。该法可用于筛选功能性蛋白质，并可在蛋白质水平筛选基因的多态性，从而能有效地将基因与蛋白质结合在一起。2.4蛋白质芯片蛋白质芯片是高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术。它是指在硅物质如玻璃等固相支持物表面高密度排列的探针蛋白点阵，通过如抗原—抗体专一性结合等各种相互作用可特异地捕获样品中的靶蛋白,然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析。蛋白质芯片上的探针蛋白可根据研究的目的不同，选用抗体、抗原、受体、酶等具有生物活性、高度特异性和亲和性的蛋白质。具体制备过程可参阅文献。与DNA芯片一样，蛋白质芯片同样蕴涵着丰富的信息量，必须利用专门的计算机软件包进行图象分析、结果定量和解释。它能够同时分析上千种蛋白质的变化情况，可用于疾病诊断，蛋白质相互作用等研究，是蛋白质组学研究比较有发展潜力的技术工具。在最近的Science杂志上，Snyder等人报道了他们制作的一种蛋白芯片，可以在一次同时分析5800个酵母蛋白，迅速鉴定出能与成千上万排列有序的酵母蛋白相互作用的蛋白。利用这一技术,，他们共发现了33种可以结合钙调蛋白calmodulin的新蛋白和52种可以结合phosphotidy_linositides的蛋白。其中calmodulin是一种涉与钙离子信号的广泛存在的蛋白；phosphotidylinositides是一种与细胞生长、分化与细胞骨架重排有关的细胞膜蛋白。2.5蛋白质组学研究中的生物信息学(Bioinformatics)蛋白质组的信息主要包括蛋白质的性质、结构与功能,这也是当前蛋白质组学研究的主要任务。有关这方面的研究将大大难于以前仅仅序列的研究。并且蛋白质的二级和三级结构要涉与复杂的运算软件的使用。要完成这些繁重而复杂的任务，没有当今生物信息学的鼎立相助是不可想象的。生物信息学是指生物学与计算机科学以与应用数学等学科相互交叉而形成的一门新兴学科,通过对生物大分子信息的获得、加工、存储、分类、检索与分析，以达到理解这些生物大分子信息的生物学意义。可用于寻找蛋白质家族保守序列和对蛋白质高级结构进行预测。随着相关软件的成熟与发展，如今该学科已经成为基因组学和蛋白质组学研究中强有力的必不可少的研究手段。虽然蛋白质组学较传统的蛋白质研究方法有很多根本性的进步，但它也有很多不完善和局限的地方。比如应用2-D凝胶电泳进行蛋白质组学分析时，就有可能检测不出低丰度蛋白、跨膜和膜相关的蛋白质,而这些蛋白在蛋白转运和信号转导等许多生物学作用中有重要意义，这时候传统的免疫学方法就能发挥有效的作用。蛋白质组学主要适用于大批量的研究和生物标记物的搜寻，以与获取细、组织或器官整体表达的数据。简言之,蛋白质组学是高通量的分析，是对传统方法的补充。通常我们把蛋白质组学分析视为一个扫描工具，用以产生一系列的候选者，再以传统的方法进行更深入的研究和功能分析。蛋白质组延续基因组发展而来并与之对应，但是又有着不同之处:一个生命体只有一个确定的基因组，为组成该机体的所有细胞共有；而蛋白质组则是一个动态的概念，它不仅在同一个机体的不同组织和细胞中不同，在同一机体的不同发育阶段、不同的生理条件或疾病状态下都是不同的。正是这种复杂的表达模式,构成了生命活动的复杂性和多样性，也正是这种复杂的生命现象带给了我们无穷挑战和契机。对于蛋白质组学技术方法的了解和掌握无疑将赋予我们更具开拓性研究的利器。3蛋白质组学发展趋势在基础研究方面，近两年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，如细胞生物学、神经生物学等。在研究对象上，覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围，涉与到各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等。在未来的发展中，蛋白质组学的研究领域将更加广泛。在应用研究方面，蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一。在对癌症、早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面，蛋白质组技术也有十分诱人的前景。目前，国际上许多大型医药公司正投入大量的人力和物力进行蛋白质组学方面的应用性研究。在技术发展方面，蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存，各有优势和局限的特点，而难以像基因组研究那样形成比较一致的方法。除了发展新方法外，更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征。另外，蛋白质组学与其他学科的交叉也将日益显著和重要。这种交叉是新技术、新方法的活水之源，特别是蛋白质组学与其他大规模科学如基因组学、生物信息学等领域的交叉，所呈现出的系统生物学研究模式，将成为未来生命科学最令人激动的新前沿。国内从1997年开始开展蛋白质组研究，其中，中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所建立的蛋白质组研究中心在2000年的Electrophoresis上发表了我国第一篇蛋白质组研究论文，并在生命科学研究院生物信息中心的协助下建立了我国第一个大型的蛋白质组数据库并实现了网络共享(www.sibsproteome.org)。军事医学科学院和湖南师范大学也于2001年相继发表了蛋白质组研究论文。国家自然科学基金委员会于1999年支持了蛋白质组重大项目，经过四年的发展，国内已形成一支蛋白质组研究队伍,并拥有主要的研究技术和装备，目前，已建立起基本蛋白质组平台技术的有中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组研究中心和军事医学科学院。已开展相关研究的单位还有湖南师范大学生命科学院、中国科学院大连化学物理研究所、复旦大学等。2001年，我国的蛋白质组研究又进入了一个迅速发展的新阶段，其主要标志是国家科技部将蛋白质组研究确立为“973”和“863”的项目。在我国大力支持下，今后对蛋白质组的研究工作会发展的更为迅速，技术更为完善。尽管蛋白质组研究还处于初期发展阶段，还存在很多不尽人意的地方，但是我们可以期望随其深入发展，蛋白质组学研究在揭示生命活动的规律上会有所突破，并对探讨重大疾病的机理、疾病诊断、疾病防治和新药开发提供重要的理论依据。相信随着生物技术发展的深入和纳米技术的兴起，将为蛋白质组分析技术的发展、完善或突破带来新的生机，基因组学、蛋白质组学、信息组学的蓬勃发展使21世纪将成为一个整体细胞生物学的时代。4前景与展望近年来，利用已有的工作基础和技术储备的特性，科研工作者已探索了农业生物蛋白质组的快速经济分离鉴定方法,，包括双向电泳样品制备方法改进、蛋白质组预分离、蛋白质组多维色谱分离、蛋白质复合体分离、荧光素标定蛋白、纳升级色谱分离等。随着研究的不断发展和深入，在完善现有的研究手段的同时，还必须发展一些新的研究技术。今后研究的重点是：功能蛋白和差异蛋白分析，主要技术路线是双向电泳分离、多维色谱分离和质谱分析；蛋白质修饰分析，主要技术路线是修饰蛋白的富集分离和质谱分析；蛋白质复合体和蛋白质相互作用网络分析，主要利用现有的蛋白质研究技术和设备开展蛋白质复合体的分离鉴定等。蛋白质组学是一门新兴的学科，虽然刚刚起步，却为大规模地直接研究基因功能提供了强有力的工具。目前，蛋白质组学在农业科学研究的多个领域得到初步应用，但低丰度蛋白的获得和植物蛋白的定量仍然是一个巨大的挑战。蛋白质组学不仅阐明生命活动规律提供物质基础，也能为探讨重大疾病的机理、疾病诊断、疾病防治和新药开发提供重要的理论依据和实际解决途径,解决了在蛋白质水平上大规模直接研究基因功能的问题。不难看出，它是基因组计划由结构走向功能的必然，是生命科学由分析走向综合的必经之路，也是连接微观分子