《医学分子遗传学》(研究生)全册配套完整课件

《医学分子遗传学》(研究生)全册配套完整课件医学分子遗传学课程情况参考书目：《人类分子遗传学》（原书第三版）T.斯特罗恩，A.P.里德编著

孙开来主译

科学出版社《癌生物学》

RobertWeinberg著詹启敏刘芝华主译

科学出版社课程情况任课教师：杨雪艳讲师生命科学学院

主讲原理部分

手机mail：xueyanyang@

逸夫科技楼306室陈红岩讲师生命科学学院

主讲技术部分

课程情况考试方式：闭卷题型：选择、名词解释、简答成绩：30%A和A-课程要求：对基本概念、基本原理的掌握；认真听，勤思考，多看文献，了解学科发展前沿。第一讲绪论什么是医学分子遗传学？生物学遗传学医学遗传学医学分子遗传学变小了？变大了？医学遗传学医学遗传学分子生物学医学分子遗传学疾病发生机理、传递规律、诊断方法及防治措施维护健康和健康丧失后使之恢复的技艺

基因突变，表达异常，疾病发生医学分子遗传学研究对象：人类健康与疾病研究手段：分子遗传学结合传统的细胞生物学、生物化学等学科的技术，结合临床研究研究目的：筛选与鉴定疾病致病基因及其与环境因素的相互作用，揭示基因表达异常（突变等）与疾病发生的关系，建立在分子水平的疾病的基因诊断，筛选和鉴定疾病治疗药物靶点，指导疾病治疗，进一步实现对疾病的基因治疗。医学分子遗传学为何重要？人类社会面临的挑战？人口资源环境健康战争以上各点影响着人类的生存及生存质量，在生存质量中人类自身的健康越来越受到关注，几乎成为核心问题。人类的生存史就是一部疾病斗争史疾病与人类共存疾病帮助人类完善自身疾病淘汰人类的弱势群体人类进化的动力之一新发展，新问题？一方面医疗保健的发展,生活质量的提高，使人均寿命延长。另一方面人类面临一大批新老疾病的威胁：心血管病糖尿病艾滋病肿瘤其它传染病这迫使我们不得不面对它，研究它，对付直到征服它。如何从进化的角度看待这些疾病？人类群体健康延续面临的压力环境胁迫逐步加大(人类自身造成的结果)；人类社会从自然界中剥离、独立，逃避了自然选择。这大大加重了人类的遗传负荷。我们所能做的就是大力发展医学分子遗传学及其它相关学科，提高疾病的驾驭能力。医学遗传学的研究内容遗传性疾病：大多为终身性疾病发病率增高治疗难度大疾病的遗传因素遗传病感染性疾病外伤遗传性疾病与疾病的遗传因素疾病都是遗传和环境相互作用所致！spontaneous15%Gene-environmentinteraction78%puregenetic5%pureenvironment2%EnvironmentGenetic--++20%80%100%17%83%Schulte,1994疾病与遗传和环境的相互关系“Geneticsloadsgun,

butEnvironmentstrigger”医学遗传学的发展历史医学遗传学的发展历史缓慢发展期启蒙认识：一母生九子，子子不相同兄妹不宜通婚选媳妇探查兄弟是否有遗传病孟德尔遗传定律的发现本世纪初，Garrod与Batson首次运用孟德尔遗传定律解释一些罕见遗传病的遗传方式医学遗传学的发展历史快速发展期：生化遗传学：对于遗传代谢性疾病的认识生化技术的应用：电泳技术、免疫技术、肽链和氨基酸分析技术、酶促反应动力学研究技术等；血红蛋白病、G6PD缺乏症、苯丙酮尿症等疾病病理机制。细胞遗传学：染色体异常综合症21三体、XO、XYY等染色体异常综合征的发现染色体显带和FISH生化遗传学研究人类遗传物质的性质，以及遗传物质对蛋白质合成和对机体代谢的调节控制。1902年：GarrodA首次提出先天性代谢病概念1941年：BeadleGW和TatumEL，红色链孢霉突变“一个基因一种酶”。1949年：PaulingL，镰状细胞贫血症、“分子病”。

1956年：IngramVM，珠蛋白Glu

谷→Val缬。镰刀形贫血症细胞遗传学研究人类染色体的正常形态结构以及染色体数目、结构异常与染色体病关系的学科。1923年：PainterTS，2n＝48条，XX、XY1952年：HsuTC（徐道觉）低渗处理法1956年：TjioJH（蒋再兴）和Leven，46条1959年，Lejune发现21三体1971年，染色体显带技术1986年，FISH唐氏综合症——21三体医学遗传学的发展历史飞跃发展期：基因水平研究疾病——医学分子遗传学重组DNA技术、PCR、基因芯片、高通量测序等分子技术当前的研究重点：功能基因组研究遗传病病因及发病机制的阐明肿瘤遗传学疾病的分子诊断和风险评估药物遗传学与药物基因组学医学表观遗传学基因治疗经典vs现代经典医学遗传学vs现代医学分子遗传学疾病的研究方法经典：症状－－基因产物－－基因现代：反求遗传学定位克隆经典医学遗传学vs现代医学分子遗传学疾病的致病机制研究经典：细胞、生化

局限性：不适用于所有的遗传病

不能从根本上阐明致病机制现代：分子水平研究疾病病理机制DNA水平、RNA水平、蛋白水平基因的结构、功能、表达和调控经典医学遗传学vs现代医学分子遗传学疾病的诊断方法经典：细胞学、组织化学、细胞遗传学、免疫学、生物化学现代：基因水平，特别是PCR技术经典医学遗传学vs现代医学分子遗传学疾病的防治措施预防经典：一级预防、产前预防现代：直接在DNA水平对患者、携带者和胎儿进行诊断治疗经典：激素替代、食物限制、蛋白替代、移植、药物、手术现代：基因治疗医学分子遗传学进展漫谈

人类基因组计划(HGP）草图绘制已经成功，功能基因组研究将为疾病的预防，诊断和治疗奠定基础。后HGP时代二代测序GWAS（全基因组关联研究）CNV（拷贝数变异）基因芯片

生物芯片的先锋

高通量测序技术从遗传病到肿瘤从Southern到PCR从组织到外周血病毒疾病检测显神威基因芯片的诞生DNA指纹基因诊断神奇的PCR：1变成1000万基因算命？基因药物新的药物工厂“

病毒”也是幸运的使者基因治疗世界首例ADA（腺苷脱氢酶）缺乏症基因治疗患者胚胎干细胞与治疗性克隆胚胎干细胞诱导分化我国医学分子遗传学研究现状总体水平落后ESI评比不断涌现显著性成果致病基因基因诊断基因治疗Omics研究从人类基因组计划（HGP）1%到HapMap

计划10%；一批微生物基因组遗传密码破译：痢疾杆菌福氏2A、钩端螺旋体、表皮葡萄球菌、腾冲嗜热菌、弗氏志贺氏菌等基因组完成血吸虫基因组、发育相关基因研究国际“人类蛋白质组计划”正式启动。我国科学家领衔其中的“人类肝脏蛋白质组计划”疾病基因克隆克隆了神经性耳聋、家族性房颤基因、人类短指综合症基因、A-1型短指（趾）症、乳光牙本质Ⅱ型基因、白内障的致病基因，骨质疏松致病基因、帕金森病关键基因。鼻咽癌易感基因被定位，高血压、2型糖尿病、肺癌、前列腺癌易感基因被鉴定，全面研究和鉴定了银屑病，白癜风，肝癌和食管癌致病易感基因。疾病诊断治疗取得丰硕成果血友病B基因治疗，TK基因治疗恶性脑胶质瘤，免疫基因治疗，深圳赛百诺公司P53腺病毒载体，用于肿瘤基因治疗重组人基因工程药物链激酶、TNF、TPO、重组血管内皮抑素Ⅲ等药物进行了维甲酸，三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞白血病治疗研究取得重大突破，使得该白血病率先得到有效治疗甚至治愈。丙肝病毒分子基础研究取得多项创建性成果—疫苗研究、分子机制阐明、诊断试剂开发奠定了基础转基因动物技术获重大突破复旦大学发育生物学研究所的科研人员在世界上首次创立哺乳动物转座因子系统，极大提高了基因剔除小鼠研究的功能，转基因羊、转基因牛、克隆牛、克隆羊、人羊嵌合体、iPS克隆鼠研究取得重要成果，为疾病模型、生物医药和器官移植疾病治疗和干细胞治疗奠定了基础。谢谢大家！转基因动物与医学遗传学什么叫模式生物（Modelorganism）TechnicaldifficultyComplexityDrosophilazebrafishmousehumanC.elegansyeast生物体由低等向高等、由简单向复杂的进化过程中，很多生物学过程在不同生物物种中是非常保守的。因此，可以通过选择合适的物种，对其开展研究，获得对生命基本规律或者人类健康的认识，这样的物种就称为模式生物模式生物的特点1)有利于回答研究者关注的问题，能够代表生物界的某一大类群；2）对人体和环境无害，容易获得并易于在实验室内饲养和繁殖；3）世代短、子代多、遗传背景清楚；4）容易进行实验操作，特别是具有遗传操作的手段和表型分析的方法。。常用的模式生物大肠杆菌、酿酒酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、大鼠、小鼠等，在高等植物研究中常用拟南芥等.这些物种的基因组最近都已在国际社会的努力下被测序完成。怎样选择合适的模式生物1.选择的模式生物必须可以用来研究想要研究的问题。2.如果有多个模式生物符合第一条，那么尽量先选择最简单的一种。

上世纪八十年代初的时候，一些人开始研究细胞周期的调控。细胞周期调控一般来说指的是有丝分裂的调控，所以只能选择真核生物，大肠杆菌就不行了。所有的真核生物都要进行有丝分裂，理论上选哪个来研究都可以，这个时候就要选择最简单的，也就是单细胞的。实际上当年研究细胞周其主要用了三种常见模式生物：酵母，海胆和爪蟾。其中海胆和爪蟾用的都是卵，也都是单细胞的，简单。用酵母是因为酵母遗传学很发达。用海胆是因为可以得到许多细胞周期同步的卵，便于用生化方法研究。用爪蟾的卵是因为它比较大，便于进行显微注射检测体内活性。例子（一）例子（二）细胞凋亡的研究。只有多细胞生物才会进行凋亡，单细胞生物是不会的。（最近由文章指出单细胞生物也有凋亡，不过还存争议）那么单细胞生物就不能用来研究凋亡，理论上任何多细胞生物都可以。事实上细胞凋亡的研究使用的正是最简单的多细胞模式生物：线虫。Escherichiacoli(E.coli)大肠杆菌（E.coli

）属肠细菌家族（Shigella,Salmonella,

Yersinia，etc），在自然界中广泛存在适合实验室培养（可以液体培养和固体培养），安全，培养条件简单，生长迅速，克隆方便，基因操作简便是分子生物学，遗传学和生物化学研究中的重要模式生物也用于人类感染性疾病和其他微生物研究的模式生物1997完成测序，4.3M，4400基因，近一半功能不清.海洋中的刺客——海胆

海胆（seaurchin）是生物科学史上最早被使用的模式生物，它的卵子和胚胎对早期发育生物学的发展有举足轻重的作用。早在1875年，OscerHertiwig（1849-1922）就开始以海胆为材料研究受精过程中细胞核的作用。1891年，HansDriesh（1876－1941）在显微镜下把刚刚完成第一次卵裂的海胆胚胎一分为二，结果发现，分开后的两个细胞各自形成了一个完整幼虫。这一实验的意义在于证明胚胎具有调整发育的能力，为现代发育生物学奠定了第一块观念里程碑。1890年后，海胆更在受精和早期胚胎发育的研究中起了重要作用。同种海胆精卵表面分子的特异性识别、精子顶体反应、卵皮质反应等现象的发现，为受精生物学奠定了最初的基础。Caenorhabditiselegans自由之虫——线虫1.细胞程序性死亡的遗传调控机制2.RNAi及其作用机制3.秀丽线虫的功能基因组学及其他研究(衰老和寿命）线虫在生命科学研究中的重要贡献Drosophilamelanogaster揭示遗传规律的王牌——果蝇

果蝇都是被用来研究遗传发育及行为生物学的理想模式生物果蝇的“同性恋”果蝇求爱4步曲:雄果蝇发现异性的存在，便追上去。然后“温柔的触碰”，用前腿轻轻地敲打雌果蝇的身体，促使对方释放出信息素——昆虫的催情药。第三步是“唱情歌”，雄果蝇伸出一只翅膀，以特定的方式振动，发出特殊的声音。一只正常的雄果蝇，会花上两分钟来完成这前三个步骤.第四步则是”云雨之欢”.耶鲁大学的KulbirGill在研究雌性不育的问题时发现,有一群基因变异的雄果蝇不仅追求异性，也追求同性，而且会回应同性的追求。而普通的雄果蝇不会主动追求同性，在被同性追求时会抗拒，拍着翅膀又踢又打。Gill为此把这个基因叫做fruity，即美国俚语里的“男同性恋”。普通雄果蝇(右)追逐雌果蝇；而fru基因变异的雄果蝇追求同性，有时它们会前后连成一串，每一只雄蝇都追求自己前面的那只雄蝇.异性恋同性恋异性恋植物中的果蝇——拟南芥特点：（1）形态个体小，高度只有30cm左右；（2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需6周左右；（3）种子多，每株每代可产生数千粒种子；（4）形态特征简单；（5）基因组小，只有5对染色体。虽然这种植物在许多方面简单，但它的大多数基因与其他复杂的植物基因具有很高的同源性，另外，由于这种植物的全部基因组测序已经完成，因此可以预测，拟南芥在植物学所有领域的研究中将发挥更大的作用。zebrafish(Brachydaniorerio)实验室明星——斑马鱼1．成鱼个体小，方便饲养。2．发育快、繁殖能力强、性成熟期短。受精后约40分钟，就完成了第一次有丝分裂。24小时后，主要器官已经形成，脑室、眼睛、耳和体节等清晰可见。相当人类第28天的胚胎。3个月可达到性成熟。3．体外胚胎发育方便观察和操作4．拥有较完善的胚胎和遗传学操作技术5．品系资源丰富目前研究中常用的是斑马鱼野生型品系主要为Tuebingen品系。此外，还有3000多个突变品系和转基因品系。

斑马鱼作为模式生物的优势最小的哺乳动物之一(25-40g)，世代周期短生物进化上与人类接近(60-75百万年)胎盘形成和早期胚胎发育与人类相近组织器官结构和细胞功能与人类相似有高级神经活动小鼠基因组测序计划已完成人类99%的基因存在于小鼠，基因同源性高达78.5%基因组93%的区域基因排列顺序与人类相同相同基因组改造的技术手段成熟小鼠作为模式生物的优势Whyme?小鼠的应用领域安全性和毒性试验：常选用小鼠进行食品、化妆品、药物化工产品等的安全性实验，急性、亚急性、慢性、毒性试验，还可做致畸、致癌致突变试验，半数致死量测定等。生物效应测定和药物效价比较

药物的筛选放射学研究遗传性疾病研究免疫学研究：各种免疫缺陷小鼠，如纯系新西兰黑色小鼠（NZB）有自身免疫性溶血性贫血，AKR/N品系小鼠有补体C5缺损，CBA/N小鼠无B细胞的免疫缺陷等，都是研究免疫机理和免疫缺陷病的良好实验动物。二、转基因动物转基因动物是指基因组中稳定地整合有以实验方法所导入的外源基因(或特定的DNA片段)的动物。这类动物由于外源性目的基因的稳定存在而赋于子代动物个体。转基因动物制备方法Pronuclearmicroinjection(原核注射）EStransgensis（胚胎干细胞）Cloning(nucleartransfer)（核移植）Retrovirusvector（逆病毒载体）Spermvector（精子载体介导）ICSI（卵母细胞胞质内单精子注射）SSCstransgensis（精原干细胞）

Transposon(转座子)1.显微注射法显微注射法是建立得最早的转基因方法，也是目前使用最为广泛、最为有效的方法。其所具有的优点是:基因的转移率高，整合效率可达30%:可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转；常能得到纯系动物;实验周期相对比较短。外源基因基因微注射移植受精卵小鼠出生转基因鼠的检测繁殖后代显微注射显微注射转GFP绿色荧光胚胎显微注射2.精子载体法&精原干细胞精子确有摄入和携带外源DNA的能力。但是，通过SMTG真正产生转基因动物的只有少数实验室。他们的报导有待于进一步证实。此外，目前还不十分清楚外源DNA在进入精核后究竟是如如何被整合到基因组，进一步揭示其机理将有助于加快通过SMTG转基因的研究和应用。精子载体法NaturalfertilizationSpermvector精子载体法优点：方便简单，嵌合体比例低缺点：重复性差机制不清实证：精子能够结合DNA假说：精子吸收、转运DNA改进：提高精子通透性的方法（质脂体，电击）精子载体法精原干细胞法

精原干细胞(spermatogonialstemcells,SSCs)的研究是近些年来干细胞研究中新兴的热点。精原干细胞(SSCs)是成年雄性哺乳动物精子发生的基础,是一种独特的在出生后仍能保持自我更新能力和具有进行定向分化潜能的细胞,也是唯一一种向后代传递遗传信息的成体细胞。将精原干细胞在体外培养经基因修饰之后,再进行移植入受体动物睾丸,使之分化为精子进行交配,产生后代,这一技术路线可以用于转基因动物的制作。

把外源基因直接整合进精原干细胞,在细胞水平上筛选,继而自体或异体移植,借助受体曲精细管的生精环境产生转基因精子,通过自然交配生成大量转基因后代。这一技术供体来源广泛,实验成本低廉,且生产周期短,应用前景广阔。精原干细胞法适合大片段DNA或人工染色体（YAC、BAC、MAC…)嵌合体比例低效率高操作复杂，技术难度大涉及受精机理1999年，转基因小鼠(Perryetal,Science)2001年，BACandMAC基因小鼠(Perryetal,NatureBiotech)2004年，YAC基因小鼠(Pedrodetal,BiolReprod)精原干细胞法哺乳动物核移植是指将胚胎单个卵裂球或体细胞核(核供体)移入去核的成熟卵母细胞或受精卵(核受体)中，采用一定的方法激活卵母细胞，使核供体和核受体融合为重构胚，经移植后发育成新个体的技术。通过核移植，可以不经过有性繁殖过程，连续不断地复制遗传上相同的胚胎，再借用胚胎移植技术，生产大量基因型相同的动物系或动物群体。根据核供体的不同分为胚细胞核移植(胚胎克隆)和体细胞核移植两种。3.核移植法*动物所有体细胞(红细胞除外)的核中都包含了发育所需的全部遗传信息核移植法原理核移植法核移植法核移植法核移植技术的应用

①畜牧生产方面：培育良种动物。②保护濒危动物。③医药卫生方面：生产医用蛋白、组织和器官移植等。核移植技术存在的问题

①成功率低。②克隆技术的各个环节有待进一步改进。③克隆动物存在健康问题，表现出遗传和生理缺陷。将ES细胞植入动物囊胚后,可参与宿主胚胎的形成,直至达到种系嵌合,因此,可将其作为一种载体,把外源DNA导入ES细胞就可以实现由此发育而成的转基因动物。该方法的优点是外源基因的整合率很高,约50%,整合率在生殖细胞中的比例约为30%。缺点是不易建立ES细胞系。4.胚胎干细胞途径胚胎干细胞途径胚胎干细胞途径胚胎干细胞途径5.逆转录病毒转染法1974年，Jaenisch等人将SV40DNA导入小鼠早期胚胎的胚泡内，在所发育成的成体小鼠中，发现有SV40DNA存在。由于逆转录病毒具有感染效率高、宿主范围广、结构简单易于准确控制等特点，是早期胚胎外源基因导入的一种有效方法。优点：1.外源基因在受体细胞的基因组中通常是一个拷贝整合。2.整合通常发生在逆转录病毒的LTR中，保证了外源基因结构的完整性2.不需要昂贵的显微注射设备缺点：1.做成的转基因小鼠都是嵌合体2.能被导入的基因的大小有一定限制，通常为10kb左右。逆转录病毒转染法方法优缺点原核显微注射

传统方法，主要用于小鼠转基因，在大动物上，转基因效率不到1%，而且随机整合可能引起的有害的基因突变慢病毒性载体

转基因效率高，但是慢病毒性载体不能携带大的DNA片段(>10)BAC,YAC载体

可携带大的DNA片段(BAC:300Kb,YAC2M)，BAC较YAC更理想精子载体

优点是简单易行，缺点是效果不确实核移植,胚胎干细胞

优点是提供了对细胞进行转染，培养和选择的机会。但是对胚胎进行显微注射和随后的胚胎移植，影响胚胎的成活率精原干细胞可以大量分裂增殖和自我复制，源源不断地产生大量的精子，生产转基因动物不需要显微注射-胚胎移植，从而提高了转基因效率

转基因动物的鉴定BiopsySouthernblotPCRanalysis(9.5dpc)GFP+,GFP-embryosGFP+tailGFP-,GFP+mice转基因动物的鉴定基于表型三、转基因动物在医学遗传学上的应用1.正常基因缺失型疾病的转基因动物模型2.正常基因过量表达而引起的疾病模型3.致病基因表达而引起的疾病模型（一）遗传病的转基因动物模型（二）传染性疾病的转基因小鼠模型适用于那些对人类危害大、流行性强、其致病原对常用实验动物又不易感的传染性疾病。（如：乙肝和艾滋病）将病原体的基因组DNA通过显微注射导入小鼠受精卵的雄原核，以得到基因组中整合有所导入的病原体DNA的转基因小鼠，在根据组织学及血清学等方面的指标，筛选出符合医学实验要求的小鼠，并按一定的方式交配，从而得到稳定的转基因小鼠品系，作为实验研究的动物模型。（三）转基因小鼠在肿瘤学中的应用1.肿瘤发生的分子病理学研究：癌基因是如何表达？表达的产物是如何发生生物学效应的。2.肿瘤的防治研究：有效药物和治疗方案的筛选3.化学药物的致癌性检测（四）炎症性疾病类风湿关节炎转基因动物研究中存在的问题及对策存在问题：1.制作转基因动物成功率低、成本高2.外源基因表达水平不高3.造成宿主基因突变启动子的选择整合的转基因表达受位置效应和基因座结构的影响1.导入大片段基因2.基因搭救和共整合3.增添基质附着区（MAR)基因诊断

一、基因诊断概念二、基因诊断方法三、基因诊断实例本章主要内容医学诊断临床检体诊断影像学诊断实验室诊断组织（细胞）病理诊断基因诊断概念实验室诊断生物化学检验免疫学检验血液学检验微生物学检验基因诊断基因诊断概念基因诊断：利用分子生物学技术从DNA水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷，又称DNA分析法。广义的分子诊断：包括DNA、RNA、蛋白质分析。

传统的诊断：表现型→基因型基因诊断：基因型→表现型（逆向诊断）基因诊断概念基因诊断的特征1.不受材料来源影响外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等2.症状前诊断尤其对于一些延迟显性疾病如Huntingtong舞蹈病3.产前诊断避免患儿出生，提高人口质量基因诊断概念前景2000年,DNA诊断试剂全球销售额达到一个新的水平亿美元;2004年,销售额达到20亿美元现代分子诊断试剂的生产和销售已成为现代生物技术中利润很高的一项行业.二、基因诊断技术（一）Southern印迹杂交二、基因诊断技术（二）Northern印迹杂交二、基因诊断技术（三）斑点杂交点样Probe-32P检测AB1234二、基因诊断技术（四）荧光原位杂交二、基因诊断技术（四）荧光原位杂交二、基因诊断技术（五）聚合酶链反应二、基因诊断技术（五）聚合酶链反应☆

多重PCR在一个PCR体系中加入数对PCR引物，覆盖区域不重叠用于检测同一基因多个外显子的缺失。E1E2E3二、基因诊断技术（六）实时荧光定量PCRPCR扩增反应中，引入一种荧光化学物质，对每一个循环产物荧光信号的实时检测可以得到荧光扩增曲线实现对起始模板定量和定性分析二、基因诊断技术（七）染料法的特点成本低

适合初步筛查先用SYBR筛查，再用探针法精确定量少数关键样品熔解曲线鉴定PCR有无杂带、引物二聚体无模板特异性不能分辨主带与杂带，给出的是总信号不能做多重检测每孔只能检测一个目标基因灵敏度低

适合于5000拷贝以上的基因定量信号强度与结合探针的DNA分子数成正比探针法的特点目标高特异性无需做熔解曲线，阴性结果确定重复性较好设计相对简单只适合一个特定目标公司标记，价格高探针有一定本底荧光☆PCR-SSCP（SingleStrandConformationPolymorphism）单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率的不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。二、基因诊断技术（八）

primer

↓32P-dNTP掺入PCR扩增产物↓变性↓单链DNA↓

中性聚丙烯酰胺凝胶电泳

↓12345

自显影↓

1为正常结果分析2、4、5为纯合患者

3为杂合子

.

生物芯片二、基因诊断技术（九）三、基因诊断方法及实例直接诊断——直接检测致病基因的突变基因突变类型——点突变、缺失、重复、插入等间接诊断——应用DNA多态为遗传标记进行连锁分析，确定待测者是否得到带有致病的染色体，从而间接地作出诊断

DNA多态——RFLP、VNTR、SNPDNA多态（DNAPolymorphism）：群体中每个个体DNA区域中等位基因（或片段）存在两种或两种以上的形式，对基因功能没有影响，称DNA多态。它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标记。DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3类：1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；2）重复序列多态性（VNTR）：如短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记；3）单碱基多态性（SNP）：DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。一)

限制性片段长度多态性RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP由于碱基变异可能导致限制酶切点消失或新的酶切点出现，引起不同个体DNA在用同一限制酶切割时，产生不同长度的DNA片段，称RFLP。RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是非常有用的遗传标记。AlleleII产生了新的酶切点

AlleleI

AlleleII12Kb8Kb4Kbprobe12Kb8Kb

RFLP—Southernblot检测结果

AlleleII酶切位点消失二)数目变异串联重复

variablenumbertandemrepeats,VNTR）重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态即VNTR。散在分布于染色体上。重复单位6~25bp长，称为小卫星DNA。

重复单位2~6bp长，如（TA）n,(CGG)n等，称为微卫星DNA。VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,Amp-FLP）VNTR酶切，电泳后的检测结果

大小PCR-VNTR检测PCR-VNTR三)单核苷酸多态性（SNP）（SingleNucleiotidePolymorphism）SNP：发生在基因组中的单个核苷酸的替代根据SNP在基因中的位置，分为：基因编码区SNP

基因周边SNP

基因间SNP在人类基因组中每1250个核苷酸就有一个SNPSNPs检测方法的分类一、区分SNPs位点的方法1.基于杂交的方法2.基于酶的方法3.以构象为基础的方法4.直接测序的方法二、检测分析技术1.凝胶分析技术2.荧光检测技术3.DNA芯片4.质谱检测技术145Taqman

法采用高温连接酶检测反应技术进行基因分析

其原是高温连接酶检测到模板DNA与两条探针DNA的接头处存在着碱基错配，则连接反应不能进行。左侧探针与模板有一个碱基不配对，连接反应不能进行。右侧的探针与模板完全互补，连接反应完成，进行测序后分型。MassARRAYiPLEX（分子量阵列技术)）芯片技术二、基诊断方法及实例

直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或邻近DNA序列作为探针，进行Southern杂交，或通过PCR

扩增产物，以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。主要适用于已知基因异常疾病的诊断。直接基因诊断及实例镰形细胞贫血的Gene诊断

β珠蛋白链基因第6位密码子发生突变

GAG——GTG

谷Aa——缬Aa1）Southernblot2)等位基因特异核苷酸探针

(Allele-specificoligonucleotide，ASO)诊断

已知突变Gene部位和性质，合成寡核苷酸探针，32P标记，进行斑点杂交。

NormalβΑGene——与正常ProbeβΑ杂交稳定

MutationβSGene——与异常ProbeβS杂交稳定

等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）斑点杂交结果：

βΑ/βΑβΑ/βSβS/βS

正常探针

突变探针突变型遗传病的直接基因诊断突变型遗传病的直接基因诊断SSASASAA点突变的基因检测:高分辨率溶解曲线

(HighResolutionMelt,HRM))双链饱和染料高精确度PCR仪0.02度/step高通量：1次可同时检测10-384样本。高敏度：HRM检测灵敏度达1%-0.1%，是传统“PCR+测序”方法25-250倍。特异性好：PCR产物无需后续处理，特异性达100%。操作简便：只需设计PCR引物，进行PCR反应，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限.成本低：相比传统的SNP/突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且拓展了其应用面。适用范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。传统“PCR+测序”方法难以检测大部分不能手术的患者。HRM技术优势BamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe

1）地中海贫血的基因诊断

基因不同程度的缺失可引起不同类型的地中海贫血。直接基因诊断—

缺失型遗传病的直接基因诊断

αα/αααα/α-αα/--α-/----/--

正常缺1缺2缺3缺414kb10kb缺失型遗传病的直接基因诊断Southernblot检测结果2）β地贫的Gene诊断β珠蛋白基因两侧有pstI酶切位点，pstI酶切正常可得到4.4kb片段β珠蛋白基因缺失0.7kb片段，pstI酶切则得到3.7kb片段为β0

缺失型遗传病的直接基因诊断以βGene为探针，Southernblot方法检测

βΑ/βAβΑ/β0β0/β0

4.4kb3.7kb缺失型遗传病的直接基因诊断3）DMD的基因诊断DMD属XRDMD基因是最大的基因，有79个外显子DMD基因突变主要以缺失为主，可涉及基因的不同部位E1E2E3缺失型遗传病的直接基因诊断病例外显子12345678Pm34350136476052bp535113缺失型遗传病的直接基因诊断二）间接基因诊断方法及实例

当致病基因虽然已知，但其异常性质未知时，或疾病Gene本身尚未知时，主要通过Gene和DNA多态的连锁分析间接地作出诊断。

连锁分析基于遗传标记与Gene在染色体上连锁，通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种遗传标记与疾病的关系，间接推断受检子代是否获得带有致病基因的染色体，间接地判断并做出诊断。遗传标记是基因组中的DNA多态如：RFLP，VNTR等。间接基因诊断遗传标记相关基因表型分析间接基因诊断是一种常染色体隐性遗传疾病，主要是苯丙氨酸代谢异常。由于体内的苯丙氨酸羟化酶基因突变，使体内的苯丙氨酸羟化酶活性减弱或消失，造成的食入进入的苯丙氨酸不能正常的代谢，从而使苯丙氨酸及其代谢产物在体内堆积，造成对神经系统不可逆的损伤。

1.Southernblot--RFLP诊断苯丙酮尿症(PKU)

PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可产生23kb、19kb两种等位片段，以PAHcDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交。间接基因诊断患者为19kb片段的纯合子,说明患者缺陷的PAH基因与19kb片段连锁其父、母亲缺陷的PAH基因与19kb片段连锁，其23kb片段与正常PAH基因连锁。II2为23kb和19kb片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者。间接基因诊断2.成年型多囊肾病的诊断例：成年型多囊肾病——APKD，AD，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKDGene与α珠蛋白基因3`端附近的一段小卫星DNA序列（3`HVR）紧密连锁，因此，可以通过ＲＦＬＰ连锁分析进行诊断。间接基因诊断

以3`HVR为探针，与PvuII酶切后的家系有关成员的基因组DNA进行SouthernBlot

PvuII酶切变性变性基因组DNADNA片段转膜探针杂交结果分析间接基因诊断1212345

5.7kb3.4kb2.3kb

间接基因诊断结果分析

患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段，说明致病基因与3.4kb片段连锁，并按孟德尔方式遗传。II5不含3.4kb片段，产前诊断正常。间接基因诊断3.甲型血友病诊断（PCR-RFLP）甲型血友病的基因诊断：已知甲型血友病XR，获得家系成员基因组DNA。

PCR142bpBcLI

142bp99bp43bp

电泳结果分析p1p2142bp99bp43bpBclIBclI-BclI+间接基因诊断间接基因诊断

142bp99bp12123ⅠⅡIII1间接基因诊断结果分析1）先症者II1具有99bp片段而发病，该片段来自母亲。2）II2有142bp/99bp，为杂合子。142bp来自父亲，为正常片段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。3）Ⅲ1为99bp片段如果是男性为患者（99bp片段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双方）间接基因诊断分子诊断的发展方向1）分子诊断的内容从传统的DNA诊断发展到核酸及其表达产物（mRNA、蛋白质）的全面诊断；2）分子诊断的策略从利用分子杂交、PCR等单一技术的诊断发展到有机组合多项技术的联合诊断；3）分子诊断的方法从定性诊断发展到半定量和定量诊断，核酸标记技术，特别是荧光标记技术的发展，荧光定量PCR技术等方法日益成熟；4）分子诊断的范围从单基因疾病的诊断发展到多基因病（肿瘤、心脑血管疾病、代谢病、神经系统疾病、自身免疫性疾病等）的诊断；5）分子诊断的应用多治疗性诊断发展到预防性分析评价，特别是针对高危人群进行疾病基因或疾病相关基因的筛查。基因诊断意义

现症病人的诊断：争取有效、针对性治疗。产前诊断：意义更为重要，预防遗传病患儿的出生

医学分子遗传学杨雪艳第七讲癌症的分子遗传学184第一节害群之马:基因、细胞及癌症的性质细胞叛逆者：癌症的起源肿瘤并非入侵的外敌，它们与构成机体的正常细胞同宗同门；癌细胞是离经叛道、罔顾公德、恣意妄为的细胞；细胞是在强大的选择压力下演变成为肿瘤细胞的；对于有机体而言，强有力的选择机制以防止其死于癌症由一个正常的上皮细胞转变成具有侵袭力的癌平均需要6个连续的突变。机体1013个细胞，突变率10-7186癌的多阶段演化过程187癌症是一个特立独行细胞的后代还是一帮怪异细胞集体倒戈？188肿瘤单克隆生长的证据IHforG6PDofintestinesections189190肿瘤单克隆的其他证明191第二节癌症起源的线索：外部世界如何影响细胞内部癌症起源的线索：外部环境？癌症直到19世纪仍是罕见的病种；1761年，英国医生JohnHill注意到了鼻癌的发展与长期过度吸鼻烟有关；1775年，伦敦医生Percival

Pott提出早年干过扫烟囱的男人易患阴囊癌；19世纪，德国东部沥青铀矿的矿工们患肺癌死亡；20世纪，与X线打交道的人易患皮肤癌和白血病；20世纪50年代，吸烟人群的肺癌发病率日益上升。不同国家之间癌症的发病率存在巨大差异。193吸烟增加了患肺癌的风险194不同癌症的发病率与种群和生活方式均有关195哪些环境因素会引发癌症？日本山际克三郎的兔子啮齿类动物致癌测试上千种化合物具有致癌效应致癌作用最强的化学物之一是黄曲霉毒素埃姆斯测试（Amestest）诱变力=致癌力196首次通过化学致癌物诱导产生肿瘤1951年，KatsusaburoYamagiwa诱导兔耳产生的皮肤癌标本，此肿瘤经煤焦油处理660天后收集保存。197测定致突变能力的Ames试验198火上浇油：非诱变因素的致癌物酒精：反复接触高浓度酒精会杀灭大多数口腔和咽喉内壁细胞。组织内部毗邻细胞得到指令，进行生长和分裂来填补空缺。HBV：在受感染者肝脏内长期且大批杀灭肝细胞，未受感染的幸存细胞前仆后继地生长、分裂。雌激素：在经期和孕期，雌激素促使乳腺管内壁细胞增殖。乳腺上皮细胞每个月都要繁殖后死亡，周而复始。199第三节蛛丝马迹：搜寻原癌基因病毒与肿瘤病毒导致人类许多人类疾病(如狂犬病，

天花，感冒等）绝大部分病毒因病毒在细胞内疯狂复制增殖,杀死细胞而引起疾病某些病毒的增殖过程不杀死细胞，还导致细胞不受控制地疯狂生长20世纪70年代证实肿瘤病毒诱发的肿瘤只占人类肿瘤一小部分肿瘤病毒研究提供了揭开隐藏数百年的人类肿瘤秘密的钥匙癌症是一种基因病，可用分子生物学和遗传学工具进行分析研究肿瘤病毒革命了人类癌症病理学的研究201PeytonRous－

肿瘤病毒学的奠基人

1910年发现劳氏肉瘤病毒(Roussarcomavirus,RSV)引发鸡肿瘤50多年后(1966)获得NobelPrizeinMedicineandPhysiology202Roussarcomavirus(RSV)induceschickentumors203化学致癌说vs

肿瘤病毒说化学致癌说：肿瘤细胞内的致癌基因并非源自病毒，是癌细胞自发产生的；致癌基因是由化学物质或辐射引起正常细胞的基因改变。肿瘤病毒说：所有肿瘤细胞携带的是入侵肿瘤病毒强加的致癌基因；广泛分布，偶然作恶可以解释为何大多数人类癌症的表现不同于传染病。204Asetbackinresearchontumorviruses1913年丹麦人JohannesGribFibiger报道了大鼠胃中的螺旋菌导致胃瘤

1926年JohannesGribFibiger获得了NobelPrize所称胃瘤实际上是一些组织变形的胃表皮(meteplasticstomachepithelia).

组织变形的原因是严重缺乏维生素丢掉了Fibiger的实验动物丢弃了感染性致病因子会引发肿瘤的学说205被RSV转化的

鸡胚成纤维细胞失去了接触抑制特性

在培养皿中形成foci相差光镜照片扫描电镜照片正常CEFRSV转化的CEF206RSVviruscarriesanextratransforminggene,srcRSV病毒就有两种突变株:一种突变株能在感染细胞后产生新病毒，但不能转化细胞，

另一种突变株感染细胞后能转化细胞但不会产生新病毒。207在感染病毒和未感染的细胞中检测src基因1974,MichaelBishopHaroldE.Varmus预期：正常细胞中没有src癌基因；而受感染的细胞则至少有一个src基因，也就是RSV病毒输入到细胞内的那个癌基因。未感染的细胞核感染病毒的细胞中都有src的存在！src本是一个正常的鸡基因！208所有鸟类都含有src基因Evolutionarytreeofthesrcgene209c-src

vs

v-srcc-src和v-src

是两个非常相近的基因；c-src是一个正常细胞的基因，其作用与细胞的行为和个体的正常发育相匹配；

v-src

是由RSV病毒基因组携带的，是非常强的致癌基因，能将一个正常的细胞转化成一个肿瘤细胞。210发现c-src原癌基因的革命性意义其他的诱变机理可能跟是激活了一个细胞原癌基因，将其转变为癌基因；可能致癌信息已经存在于正常细胞基因组中，等待着被发现；一个单个的癌基因可以引起细胞的一系列变化：包括性状、代谢和生长行为；少数的基因足以将正常细胞变成癌细胞；其他致癌反转录病毒也许获得了其他与src无关的细胞原癌基因；其他细胞原癌基因隐藏在基因组中，等着被经过的反转录病毒攫取，激活。211各类致癌逆转录病毒及其携带的癌基因212J.MichaelBishopHaroldE.VarmusTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1989fortheirdiscoveryofthecellularoriginofretroviraloncogenes213第四节一失足成千古恨：人类肿瘤中的癌基因人类肿瘤中发现细胞癌基因Transfection,apowerfulmethodtodetecttheoncogenefromhumantumorDNA215克隆人类膀胱癌基因H-ras的策略1x103Alu/cell1Alu/cell1x106Alu/cellT24/EJhumanbladdertumorcellcellDNA216定位人类膀胱癌基因H-ras217人类膀胱癌基因H-ras携带一个点突变这个H-Ras的发现代表着癌症研究的的一个里程碑。首次发现一个基因的单个突变可诱发人类肿瘤的生长。这是一个体细胞突变产生的遗传变异。218活化原癌基因的机制原癌基因点突变基因扩增原病毒插入激活

染色体易位导致原癌基因过表达染色体易位产生新结构新功能的致癌蛋白基因的部分缺失突变

219基因扩增导致原癌基因激活erbB2/neu/HER2致癌基因扩增与乳腺癌

患者生存率反相关220人乳腺癌erbB2/neu/HER2

致癌基因扩增221N-myc扩增与神经母细胞瘤的预后N-myc高扩增(>10拷贝)病人在癌症确诊和治疗后的复发和癌症相关症状再现率的比例远高于N-myc低扩增病人，

时间也提早很多。222Myc基因家族的染色体内、外的扩增Homogeneousstainingregions(HSRs)Myc家族的染色体内扩增doubleminutes(DMs)Myc家族的染色体外扩增223经常被扩增的染色体区域和其携带的已知基因224活化原癌基因的机制原癌基因点突变基因扩增原病毒插入激活

染色体易位导致原癌基因过表达染色体易位产生新结构新功能的致癌蛋白基因的部分缺失突变

225原病毒插入导致原癌基因激活

>80%的鸡白血病中AMV原病毒插入到c-myc的5’端；

大部分插入后转录方向与c-myc一致。226活化原癌基因的机制原癌基因点突变基因扩增原病毒插入激活

染色体易位导致原癌基因过表达染色体易位产生新结构新功能的致癌蛋白基因的部分缺失突变

227染色体易位导致原癌基因过表达2:8

chain

(light)9％14:8heavychain75％22:8lchain(light)16％228B-细胞染色体易位导致正常c-myc基因在重链基因启动子控制下组成型高表达229由于染色体异位导致的癌基因激活引起的各类癌症FromG.M.Cooper,Oncogenes,1995230活化原癌基因的机制原癌基因点突变基因扩增原病毒插入激活

染色体易位导致原癌基因过表达染色体易位产生新结构新功能的致癌蛋白基因的部分缺失突变

231染色体易位产生新结构新功能的致癌蛋白(9:22)染色体易位形成bcr-abl致癌基因，导致白血病。bcr:

breakpointclusterregionabl:

最初在Abelsonmurineleukemiavirus发现的致癌基因232bcr-abl融合产生导致三种不同白血病的三种新致癌蛋白AcutelymphocyticleukeamiaChronicmyelogenousleukeamiaChronicneutrophilicleukeamia233活化原癌基因的机制原癌基因点突变基因扩增原病毒插入激活

染色体易位导致原癌基因过表达染色体易位产生新结构新功能的致癌蛋白基因的部分缺失突变

234基因的部分缺失突变导致生长因子受体永久性激活1/3神经胶质母细胞肉瘤中，EGF受体缺少细胞外结构域235第五节章回体小说：肿瘤的多步发育肿瘤一蹶而就还是多步发育？237癌症发育的迁延进程女性肺癌：本世纪中叶，女性肺癌仍属罕见。二战以后大批美国妇女开始抽烟，25年以后，这些女性大量死于肺癌。二战及此后十年海军造船所短期工作的人大量接触石棉，且是吞云吐雾的瘾君子。20年，30年，乃至40年以后开始死于一种罕见癌症——间皮质瘤。238癌基因一蹶而就说的问题在哪里？通过基因移植注入癌基因，以一个简单事件把正常细胞变成了癌细胞。这些细胞果真正常吗？抑或它们已经开始了部分癌症之旅？采用的是永生化的小鼠细胞，已经经历了明显的癌前改变！1983年，癌基因被注入真正正常的细胞；单单注入癌基因，即使是强有力的ras也不能使完全正常的细胞变成癌细胞！尝试将ras和myc同时注入正常细胞——这些细胞以变成癌细胞做出了回应，而单独应用其中任何一种都不能产生这样的结果。已知人类肿瘤携带多达6个突变基因。239第六节癌症发生的刹车系统——抑癌基因的发现细胞融合实验241癌症表型是显性的还是隐性的？推测：癌细胞表型（来源于获得病毒癌基因）在癌细胞和正常细胞的杂交中是显性的。实际上：杂种细胞没有导致肿瘤的能力！242正常等位基因的功能丢失导致癌变tumorigenicHT1080cellnormalfibroblastcellnontumorigenichybridcellfusion+tumorcellAtumorcellBnontumorigenichybridcellfusion+tumorigenicHelacellminicellcarrieschromosome11nontumorigenicHelacellfusion+243视网膜母细胞瘤pedigreeofafamilialretinoblastoma244单侧vs

双侧视网膜母细胞瘤散发性视网膜母细胞瘤：仅影响一只眼睛，通常终结于单侧单个视网膜母细胞瘤；家族性视网膜母细胞瘤：两只眼睛都发生肿瘤，最终双侧多个视网膜母细胞瘤。245二次打击模型（Knudsonmodel）

视网膜母细胞瘤：缺失了两份

拷贝的13q14;

家族性：基因组已经丢失了一份拷

贝的13q14；

第二个拷贝丢失是由于体

细胞突变。

散发癌：

两个拷贝的丢失都是由于

独立的体细胞突变事件。246通过“有丝分裂重组”导致杂合性丢失12341,4和

2,3分离1,3和

2,4分离mitoticrecombinationfrequency10-5to10-4/cellgeneration247通过“基因转换”导致杂合性丢失GeneconversionfrequencyIshigherthanthatofmitoticrec.248Rb基因发生LOH的实验证据DemonstrationofLOHattheRblocus249结肠癌中染色体臂的LOH情况250目前克隆到的抑癌基因251鉴定抑癌基因的方法针对家族性癌症：连锁分析、核型分析定位基因；定位克隆鉴定候选基因；在患者中寻找突变，并在癌组织中验证；针对候选基因：在原发癌症和癌细胞品系里寻找该基因突变；将抑癌基因引入癌细胞系：体外实验：软琼脂克隆转化分析

细胞生长抑制分析体内实验：裸鼠肿瘤生长实验构建基因敲除小鼠（纯合、嵌合、条件敲除小鼠）252医学分子遗传学杨雪艳第九讲癌症的分子遗传学（3）254第九节永生：生死有命，逃脱有术内置自杀程序：凋亡胚胎发育过程中，凋亡像雕塑家的凿子，毫不留情得剔除无用细胞；免疫系统内，不能制造适当抗体的细胞被大量抛弃；感染了各种病毒的细胞会努力激活凋亡程序，牺牲自己，保全周边细胞（p53的发现就是来源于SV40病毒）。DNA受到不可修复损害的细胞不再试图修复创伤，而是按规定自杀。凋亡的重要作用之一就是迅速消灭全身各处的越轨细胞，防止它们结党生事。细胞内部的生长控制系统存在一点点失控就会触发死亡程序。Bcl-2癌基因专门阻止死亡程序的触发，淋巴细胞通过激活该基因可以胜利大逃亡。256p53：癌基因？抑癌基因？非典型抑癌基因？将p53

cDNA克隆转染大鼠成纤维细胞，揭示它可以和共转染的ras癌基因共同转化这些细胞——类似myc的癌基因？此处的p53是以来自肿瘤细胞的mRNA为模板合成的，含有一个点突变。野生型的p53等位基因实际功能是抑制细胞增殖——肿瘤抑制基因？大多数肿瘤抑制基因纯合子失活时，几乎无一例外的由于一个或多个组织的细胞不正常增殖而导致胚胎发育中断；小鼠中两个p53拷贝的完全缺失对绝大多数p53-/-小鼠胚胎发育并无明显影响？——p53并不是简单的细胞增殖负调控者；但p53仍是一个确定的肿瘤抑制基因——当小鼠两个p53拷贝都缺失时，生命周期会变短（约5个月），大多数死于淋巴瘤和肉瘤；p53似乎是专门阻止非正常细胞的出现。257基因组卫士，死亡程序的主宰：p53细胞依赖p53感知DNA损伤，p53蛋白阻止细胞增殖，为修复机制赢得搜索和修复受损碱基序列的时间。如果消除损害，p53功成身退，细胞继续生长。如果DNA大面积受损，p53蛋白达到很高的浓度，细胞的损害评估机制将衡量受损范围，决定是否启动凋亡程序。失去p53与DNA修复机制的重大缺陷一样，摧毁了稳定的基因组。缺乏功能正常的p53，过度累积基因副本的倾向将增大1000倍。缺乏p53在肿瘤不死过程中助一臂之力：没有p53的细胞对端粒耗减视而不见，继续生长，直至修复端粒，获得永生。p53会诱发缺氧凋亡，缺乏p53细胞具有超长耐受力，可以坚持到成功建立血供的时刻。258p53激活信号和下游效应259p53等位基因在人类肿瘤细胞中的突变频率260细胞如何使p53失活的？肿瘤抑制基因的双击失活理论似乎不适合p53，无法解释突变p53为何可以转化大鼠细胞？绝大多数与肿瘤相关的p53等位基因都在编码框中存在错义密码子，而不是无义密码子；另外，p53的的序列缺失相对少见。p53是一种同源四聚体的核蛋白。答案——显性负效应（dominantnegative）！261p53点突变的显性负效应262p53水平的精细控制p53是一种半衰期才20分钟的短命蛋白。Mdm2可以与p53结合使其调节转录的功能失活，并介导泛素与之连接并将p53从核内转运到胞质中的蛋白酶体内。纯合Mdm2基因敲除小鼠在发育早期死亡，而Mdm2与p53都失活的小鼠，胚胎发育相当正常。ARF（p16的可变剪接体）可以与Mdm2结合，将其软禁在核仁内，从而快速上调p53的水平。把鸡蛋放在一个篮子里？p16可以调节pRB的磷酸化而其剪接体ARF可调节p53水平，更糟的是另一个pRB调节基因p15也与之连锁，仅仅缺失40kb的染色体DNA就可以导致所有这些遗传元件的丢失。

263p53等位基因种系突变导致的家族肿瘤易感性Li-Fraumeni综合症：孟德尔方式遗传，对多种不同的肿瘤有着高度的敏感性；5岁易发生肾上腺皮质癌→16岁易发生肉瘤→25岁时为脑肿瘤→37岁时为乳腺癌→50岁时为肺癌……大多数病例定位于19p1.3，恰好是p53的基因座位区域，测序发现存在p53等位基因突变。264触发凋亡途径细胞凋亡的内途径：由细胞内部刺激信号起始；依赖p53和不依赖p53使线粒体释放细胞色素C；细胞凋亡的外途径：受细胞外信号活化；死亡受体+肿瘤坏死因子；由杀伤靶细胞的细胞毒素T淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞起始。265p53对于癌症治疗的影响原本设想化疗和放疗通过大面积地破坏DNA可以杀死癌细胞。现在发现：剂量足以杀死癌细胞的化疗和X线，实际上并没有给癌细胞的基因组造成大范围的损伤。相反，这些破坏刚刚够激活p53和细胞凋亡程序。因此，治疗癌症不是大力击杀癌细胞，而是扭曲癌细胞的控制机制，将它们推过正常生长和凋亡的分界线。癌细胞丧失p53后常常更具有耐药性，显然是因为难以哄骗癌细胞自杀。266“世代闹钟”的存在人体中许多组织的细胞注定会死亡；细胞必死性是一种重要的抗癌自卫机制；发育着的肿瘤细胞群必定突破了细胞必死的屏障；细胞如何知道何时它用尽了分裂的份额呢？人体组织细胞中存在一个“世代闹钟”告诉它从受孕时算起细胞在生物体发展史上的位置。267体外培养的原代细胞和老化细胞的形态学差异原代细胞老化细胞268端粒的发现1938年，HermannMuller注意到染色体的末端跟其它区域的染色体不同，它非常稳