《基因表达》(研究生)全册配套完整课件

《基因表达》(研究生)全册配套完整课件《基因表达》

GENESEXPRESSION基因表达导论学生眼中的《基因表达》老师眼中的《基因表达》科学方法学中的《基因表达》分子生物学中的《基因表达》应用意义上的《基因表达》发展中的《基因表达》认知论上的基因表达文字的作用心理的作用自身的感知极限表达的相对性与事实的客观性主要参考书目书名编者出版社出版时间分子遗传学盛祖嘉等复旦大学出版社1988年基因VIII本杰明·卢因科学出版社(余龙)2005年genesIXBenjaminLewin2007基因的分子生物学Watson科学出版社(杨焕明)2005/2009考试平时成绩(20分)：2次课堂练习，每次1~2题，提前1周通知；期末考试(80分)

闭卷(40分)：10个名词解释，4个小问答。(时间40分钟，交卷后再进行开卷考试)；

开卷(40分)：4个论述题。

(时间75分钟，不准相互交流和携带笔记本)。第一章概述基因和基因表达基因（概念）的发展基因表达RNA也能提供遗传信息遗传学发展简史年份概念演进1865基因是某种特定因子1871发现核酸1903染色体是遗传单位1910基因位于染色体上1913基因在染色体上是线性排列的1927突变是基因上物理变化1931交换导致重组1944DNA是遗传物质1945一个基因编码一个蛋白1951蛋白质首次测序1953DNA是双螺旋结构1958DNA是半保留复制1961发现三联体遗传密码1977真核基因是不连续的1977DNA可以测序1995基因组首次测序1.1基因是DNA

GenesareDNADNA作为生物体独有的一种语言，是靠非常简单的A、T、C和G四种碱基来完成的生命体通过这门语言对内从时空上调控其生命活动，维持内环境的平衡和稳定；对外则对各种各样的外来刺激作出反应，保持一定限度范围内的适应性1.2基因表达DNA分子的碱基序列中隐藏了生物体中所有的遗传信息。基因表达就是将这些信息通过特定的传递链显现出来的过程基因表达的宏观主线是以中心法则提出及其后来的修正来体现中心法则的提出中心法则的修正完善基因表达与功能基因组目前克隆一个（真核）基因已经是比较容易的事情，想明确该基因的部分功能也不是很难功能基因组面临的困难之一在于如何弄清基因执行其功能的过程中是怎样受到各种各样的内因素作用，也就是说基因在表达的过程中如何受到内环境调控的真核基因表达调控的网络清晰明了之后，我们才算真正地掌握了它的“来龙去脉”真核基因结构一般真核基因的结构包括转录调控区和基因表达区两部分。转录调控区有增强子、沉默子、启动子，转录启始点之后为基因表达区原核生物的操纵子也有类似功能区域的划分1.3RNA作为遗传物质逆转录病毒基因组是单链的RNA分子感染周期中以单链RNA为模板，并由逆转录酶逆转录为单链DNA，进而合成双链DNA分子。随后的复制和转录便以这双链DNA为中间模板，这种双链DNA已成为基因组的一部分，就象基因一样可以遗传RNA的复制及逆转录现象的存在，说明了遗传信息可以以核酸的任何一种形式存在，且这两种形式之间可互相转换RNA拟酶RNA拟酶（ribozyme：也叫核糖拟酶、核酶）的发现有两个重要意义：1.使人们认识到RNA也可以象蛋白质一样，具有酶学催化活性，可应用于生化研究和基因工程研究2.为生命起源和分子进化提供了新颖有力的证据。RNA可能是生命起源中最初出现的生命大分子，早期的自我复制系统可能就是由RNA一身兼任的1.4基因和基因组原核基因多数功能相关的基因串连一起，组成以操纵元（operon）为单位的调控单元，共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的原核基因组原核生物的染色体较小基本上是单倍体原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多真核基因由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子是断裂基因（splitgene），基因间存在非编码的间隔DNA（spacerDNA）功能相关的基因构成各种基因家族，可以串联在一起，也可以相距很远真核基因组结构庞大人3×109bp；细胞存在染色质、染色体、核膜等结构一般含两份同源的基因组具有多复制起点，每个复制子大小不一含有大量重复序列非编码序列（non-codingsequence）占90%以上端粒（telomere）其他的序列原核与真核基因表达的差异

原核真核转录本多顺反子单顺反子mRNA来源不需加工必须经过加工翻译转录和翻译偶联转录和翻译是在不同时间和空间进行第二章 原核转录

Transcription

InProkaryotesDNARNAPROTEINtoday’sfocus单链书写：5’→3’正链（＋）：非模板链负链（－）：模板链有义链（sensestrand

）：反义链（antisensestrand

）：2.1转录（Transcription）通过RNA多聚酶的催化作用从双链DNA合成单链RNA，合成的方向是5’

3’，合成的序列信息与有义链一致RNA合成的模板是反义链RNA合成的必需组分：启动子（promotor），RNA多聚酶（RNApolymerase），NTPs,终止子（terminator）转录是基因表达的第一步，也是最关键的一步转录与复制的主要差异仅一条DNA模板链被转录RNA聚合酶不需要引物，能从头起始转录一个细胞的完整遗传信息中仅有少部分被转录成RNA转录远没有DNA复制精确2.2转录的基本过程

Basicprinciplesoftranscription起始（Initiation):RNA聚合酶和启动子延伸（Elongation):RNA聚合酶终止（Termination):终止子（terminator）起始InitiationRNA聚合酶与双链DNA（dsDNA）结合滑动直到发现启动子DNA螺旋解旋（unwind）在起始点（initiationsite，+1）开始合成RNAPromoter+1延伸ElongationRNA聚合酶一边沿DNA移动，一边合成RNA链。聚合酶前的DNA不停解旋而聚合酶后面DNA重新螺旋（rewind）在3’-端加上核苷酸（ribonucleotides）RNA链的生长方向是5’

3’聚合酶沿反义链上的移动方向3’

5’终止TerminationRNA聚合酶识别终止子，停止合成。终止子通常是发夹（hairpin）结构，有些终止子的需要辅助因子rho（ρ）转录复合物从DNA模板链上释放RNA链释放转录的起始延伸和终止Promoterbinding

DNAunwinding

RNAchaininitiation

RNAchainelongation

RNAchaintermination

Rho-dependenttermination

1.聚合不需要引物（primer）2.酶的活性依赖DNA，尤其是双链DNA作为模板

3.RNA合成需要Mg2+，合成方向5’3’4.所有RNA聚合酶缺3’5’外切活性，每掺入约104~105个核苷酸就会发生一个错配5.物种之间存在差异(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi2.3RNA聚合酶RNApolymeraseRNA聚合酶与DNA聚合酶比较RNApolDNApol模板双链DNA较好单/双链DNA引物需求不是起始启动子复制点（origin）延伸40nt/sec900bp/sec终止子合成的RNA模板DNAE.coliRNA聚合酶仅由一种聚合酶完成全部RNA的转录

酶的组成：

2

’

全酶（Holoenzyme）=核心酶（Coreenzyme）+

全酶（

2

’

）:RNA合成的起始核心酶（2

’

）:RNA合成的延伸E.coliRNApolymeraseBothinitiation&elongationInitiationonly36.5KD36.5KD151KD155KD11KD70KD465kdsubunitSizeaaSize（d）genefunctionalpha(

)32936511rpoA酶组装所需，与一些调节蛋白作用，也参与催化作用beta(β)1342150616rpoB催化作用：链的起始和延伸beta'(β')1407155159rpoC与DNA模板结合sigma(σ)61370263rpoD使酶定位到启动子上omega(ω)9110237rpoZ体外（invitro）恢复变性聚合酶的全部活性所必需的

亚基核心酶含有2个相同的组分由rpoA

基因编码核心酶组装所必需可能在启动子识别（promoterrecognition）中发挥作用

亚基由

rpoB

基因编码是RNA聚合酶的催化中心利福平（Rifampicin）与β亚基结合，阻断转录的起始。rpoB

基因的突变可以导致利福平抗性（resistance）利迪链菌素（Streptolydigins）抗性突变也定位在rpoB

基因，但抑制延伸而非起始β亚基可能包含2个结构域（domains

）分别对应于转录的起始和延伸

’亚基由rpoC基因编码结合2个Zn2+

离子，可能参与酶的催化作用肝素（Heparin）与b’

亚基结合，在体外抑制转录肝素还与DNA竞争结合聚合酶b’

亚基负责与DNA模板链的结合

因子（

factor）许多原核生物拥有多个s

因子用来识别不同的启动子，E.coli最常用的是s70核心酶结合s

因子后转变为全酶s

因子可以降低核心酶对DNA一般位点(non-specificDNAsites)的亲和力(affinity)(10-4)，而增加对应启动子的亲和力来实现启动子识别转录起始后(RNA链有8~9nt)，s

因子从聚合酶中释放出来和RNA聚合酶的其他亚基比，细胞中s

因子的数量较少E.coli

s70

的启动子序列有-10序列和

–35序列2.4转录单位

atranscriptionunit

ATACGTATGC+1promoterterminatorTranscribedregionRNADNATranscriptionAntisensestrandAUACG2.4.1启动子启动子序列在40bp到60bp之间-55to+20：是聚合酶结合区域-20to+20：聚合酶紧密结合区，保护其免受DNaseI的消化上游一直到-40的位置：启动子功能的重要区域-10序列和-35序列：对启动子来说尤其重要---5-8bp---GCTATTGACATATAAT-----16-18bp-------+1-35sequence-10sequence启动子序列-10序列（Pribonowbox）6bp序列以-10点为中心一致序列（consensussequence）为TATAAT开始的2个碱基（TA）和最后的T在E.coli启动子里高保守6聚体序列与转录起始点+1的距离在5bp到8bp之间，这个距离重要-35序列保守的6聚体序列以-35点为中心一致序列为TTGACA开始的3个碱基（TTG）在E.coli启动子里高保守所有启动子里的90%，-35序列与-10序列的距离在16bp到18bp之间+1-7-12-31-365’mRNATTGACAAACTGT-35regionTATAATATATTA-10region79T44T96%T95A59A51APribnowbox84795345%82TTG64ACAconsensussequences全酶与启动子结合示意（over60bp）足迹法

DNaseIfootprintDNA序列单末端放射性标记分组与RNA聚合酶结合DNaseI不完全消化消化产物变性，分离标记的DNA片断凝胶电泳，放射显影DNaseIfootprint

用CRP和lac阻遏物分析lac启动子DNAa：Sequenceladderb：NoDNA-bindingproteinsaddedc：CRP（CAP）onlyd,e,f：CRP（CAP）andrepressorbothaddedg：RepressoronlyO是阻遏物结合区C是CRP结合区Science274,1930-1931（1997）转录起始——与启动子结合核心酶（

2

’

）和DNA的结合无特异性（松散结合）

因子增强核心酶与启动子结合的特异性聚合酶沿DNA滑动寻找启动子的-35序列和-10序列，一旦发现即与之形成闭合复合体（closedcomplex）“闭合”意为DNA仍是双螺旋形式，闭合二元复合物的形成是可逆的，平衡常数KB=106-109M-1转录起始——DNA解旋由聚合酶执行的DNA解旋是必需的，这样反义链才能参与碱基配对对于多数基因来说，负超螺旋能够促进解旋以增强转录，但有例外（e.g.gyrase）与酶结合的一小块区域DNA被溶解后，转化为开放复合体（opencomplex），导致这一系列反应叫做紧密结合（tightbinding）对于强启动子，这个转化是不可逆的，速率常数K2=10-3-10-1sec-1

转录起始——RNA链的起始无需引物，由GTP（多数情况）或ATP开始插入头两个核苷酸，在他们中间形成磷酸二酯键。产生RNA、DNA和酶的三元复合物，速度常数K1约10-3sec-1最初的9nt合并无须聚合酶沿DNA移动和σ因子释放。任何一个碱基加入，聚合酶都可能释放RNA，导致流产起始（abortiveinitiations）产生流产起始后聚合酶又重新开始合成，RNA聚合酶往往需要经历多次的流产起始，产生一系列短的寡聚核苷酸。这点对于转录整体速率的控制非常重要起始成功后，酶释放σ因子。核心酶离开启动子以便另一个聚合酶可以开始，这个过程叫做启动子清除（promoterclear），最小时间需1~2秒（是个相对长的事件）启动子效率（efficiency）不同启动子间的序列差异很大，转录的效率可以相差1000倍-35序列，-10序列和转录起始点周围的序列都会影响到起始效率转录的头30个碱基序列控制RNA聚合酶对启动子的清除，因此影响到转录的速率和启动子的整体效率RNA链在起始反应中的分离有些启动子在正常情况下不足以强大，需要另外活性因子（activatingfactor）的参与才能起始转录。例如，Lac

启动子Plac

需要cAMP受体蛋白（cAMPreceptorprotein，CRP）对启动子突变的分析-10序列下降突变：T/A→G/C-10序列上升突变：G→A；GT→AA可以用解链效应解释-10序列下降突变：T/A→A/T-35序列下降突变：G/C→T/A与核心酶、σ亚基的结合有关转录起始点

Transcriptionstartsite90%的基因是嘌呤（purine）+1位点G比A更普遍通常起始位点的两侧是C和T（i.e.CGT或CAT）2.4.2延伸σ因子释放后形成pol-DNA-RNA三元复合体（ternarycomplex

），酶会沿着模板前进（启动子清除）RNA聚合酶不断解旋前端DNA，其后端DNA重新螺旋。转录泡（Transcriptionbubble，DNA解旋区，~17bp）RNA的3’部分与DNA反义链形成杂交螺旋（hybridhelix

约12bp）E.coli

聚合酶平均的移动速率~40nt/每秒，并与当时的DNA序列相关.起始与延伸2.4.3RNA链终止在终止子DNA序列处终止绝大多数终止信号（stopsignal）是RNA发夹（自身互补self-complementary）富含GC有益于这种结构的稳定终止有Rho-依赖型和非依赖型RNA分离→

DNA复性→RNApol释放终止子（Terminator）DNA的一段特殊序列，转录复合体在此分离Class1:ρ蛋白非依赖型自身互补组成茎环（stem-loop

）或发夹二级结构连续的腺苷酸（As）转录成RNA末端的一串尿苷酸（Us）Class2:ρ蛋白依赖型仅存在茎环或发夹二级结构E.coli.中一个ρ-非依赖的转录终止模型RNA转录本自身互补富含GC的序列稳定使聚合酶停滞茎环后紧接的一串

Us（4个或更多）减弱RNA和反义DNA链的结合力，利于分离ρ-依赖的终止有些基因的终止子需要辅助因子ρ蛋白来介导转录的终止

RNA

的3’末端无连续的URho结合到单链RNA的特别位点Rho水解ATP从RNA链的初生端向转录复合体方向移动，最终使聚合酶终止转录Rho蛋白（六聚体hexameric

蛋白）结合到RNA某个特定位点（72bp）沿初生的RNA链向RNApol复合体移动在Rho

-依赖的终止子处停止转录复合体解离转录终止点——λtR1研究tR1，ρ依赖的终止子不加ρ蛋白的体外转录产物大于16S，加入ρ蛋白，从右启动子（PR）转录的产物约9StR1转录终止点研究方法：RNaseT1（专一作用于RNA分子的GpN键，产物的末端为G-3’-P）分别消化9S和16SRNA9S产物（有5种产物）16S产物（仅一种产物）┅┅CAUACAUUCAAUCAAUUG在3’端的AUCAA任何一个核苷酸上都可以终止λtR1的突变分析活体内tR1的转录终止有利于溶原（lysogene），转录继续有利于裂解（lysis）有利于终止的突变cin1A：G/U→A/Ucin1Acnc1Ccnc8G不利于终止的突变cnc1C：U/A→C/Acnc8G：A/U→G/U终止效率体外转录，检测各突变型离体转录产物的长短，表中数值为终止子后/前的比值比值大终止程度小，比值小终止程度大cin1A有利于终止cnc1C有利于连读双突变cnc1C的继续转录效应大大超过cin1A的终止效应噬菌体不同时间后继续转录％

25秒40秒55秒300秒300秒（＋ρ）λ＋041410020λcin1A－－－1009λcin1

cnc18892－9495转录与翻译偶联（coupling）无义突变和转录终止核糖体（ribosomes）参与转录的终止（后面转录调控还会提到）核糖体的翻译阻止Rho蛋白赶上RNA聚合酶一个操纵子中，上游基因的突变不但影响自身的表达，还影响下游基因的表达；下游基因突变则不影响上游基因的表达多数极性突变是无义突变（nonsensemutant）或移码突变突变位置越接近N端，表达的极性效应越强；越接近C端越弱插入序列（IS）的极性效应插入序列（insertionsequence）如IS1、IS2等DNA片断插入基因中也产生极性效应IS1：与插入方向无关，两端有无义密码子，形成一大段不翻译区IS2：本身含有依赖于Rho蛋白的终止序列（tIS2），只有一种方向插入时产生极性效应天然的极性现象，T7噬菌体，靠近启动子的基因转录效率高，远离的低。基因间的距离较远第三章 原核转录调控

RegulationofTranscriptioninProkaryotes操纵子（operon）全局性调控（globalregulation）σ因子指导的调控其他调控抗终止（anti-termination）反义控制（antisensecontrol）噬菌体策略3.1操纵子（operon）由Jacob和Monod于1961年首次提出操纵子概念基因表达和调节的单位，包括：结构基因（Structuralgenes）在某个特定代谢途径中的一组酶，它们被控制共同表达控制元件（Controlelements），比如操纵基因（operator）序列调节基因（Regulatorgene(s)）产物能够识别控制元件（可以是不同操纵子上编码的）控制元件结构基因3.2E.Coli乳糖（lac）操纵子3.2.1结构基因lacZ：编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），水解乳糖（lactose）为葡萄糖（glu）+半乳糖（gal）lacY：编码半乳糖透过酶（permease）转运乳糖穿透细胞壁lacA：编码半乳糖转乙酰基酶（transacetylase）用于乳糖代谢基因lacZ,lacY,lacA是由一个启动子Plac

控制的转录单位lacZYA转录而来3.2.2操纵基因（operator）Olac：位于启动子Plac

3’-端

-5and+21与lac

阻遏物（repressor）结合3.2.3阻遏物（repressor）由LacI基因编码，相同的亚基组成有活性的4聚体，与操纵基因（Olac）结合占用一26bp的回文（palindromic）序列同时，RNA聚合酶能够与启动子结合，实际上阻遏物增加了聚合酶与启动子的结合力约2个数量级聚合酶与Plac只能紧密结合而不能起始转录缺少诱导物（如乳糖）时阻遏物几乎阻断lacZYA所有的转录Lac启动子和操纵基因序列示阻遏物结合区的回文序列3’–TTAACACTCGCCTATTGTTAA–5’5’-(lacO1)-3’阻遏物4聚体的协同作用使结合的DNA成环（Loop）基因的表达方式1.组成性表达（constitutiveexpression）此类基因只受启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，不受其他机制的调节。如管家基因（housekeepinggene）2.诱导/阻遏表达诱导（induction）--在特定环境信号刺激下表达增强的过程阻遏（repression）--表达产物水平降低的过程3.2.4诱导表达无诱导物时，阻遏物阻断lacZYA所有的表达，但仍有极低水平的转录一旦出现乳糖，低水平的透过酶允许操纵子立即响应。同时β-半乳糖苷酶能将乳糖部分转变为异乳糖（allolactose）异乳糖作为诱导物与lac阻遏物结合并使之失活细胞内的真实诱导物是异乳糖异乳糖是半乳糖苷酶反应的中间产物Gal(1→6)Glu诱导物（Inducer）乳糖作是天然的诱导物将聚合酶从启动子Plac

上释放实验室常用的一个诱导物是合成的异丙基硫代半乳糖IPTG（isopropylthiogalactoside），因为不被半乳糖苷酶分解，在实验中的浓度可以保持恒定IPTG可以迅速诱导lac操纵子结构基因的转录很多载体上克隆基因的表达是被设计成用IPTG诱导LacZ启动子的转录。如pUC19（以后再详细介绍）突变分析下降突变（downmutant）上升突变（upmutant）i-、is、Oci和O造成的突变，乳糖（或诱导物IPTG）浓度可以调节诱导物不能调节的突变，对lacI-的解释只能用启动子阻遏蛋白的负调控ｉ基因在其自身的启动子Pi控制下，低水平、组成性表达产生阻遏蛋白R，每个细胞中仅维持约10个分子的阻遏蛋白无乳糖时，Lac操纵子处于阻遏状态。R以四聚体形式与操纵基因Olac结合，阻碍了RNA聚合酶的转录起始R的阻遏作用不是绝对的，R与Olac偶尔解离，使细胞中还有极低水平的β-半乳糖苷酶及透过酶生成当乳糖存在时(无葡萄糖)，乳糖受β-半乳糖苷酶的催化转变为异乳糖，与R结合，使R构象变化，R四聚体解聚成单体，失去与Olac的亲和力，与Olac解离，基因转录开放，使β-半乳糖苷酶在细胞内的含量可增加1000倍葡萄糖效应E.Coli可以用乳糖作为碳源在含有葡萄糖和乳糖的培养基中，E.Coli只利用葡萄糖仅当乳糖为唯一碳源时，乳糖代谢所需要的酶才被合成glucose＋＝葡萄糖代谢glucose＋，lactose＋＝葡萄糖代谢glucose－，lactose＋＝乳糖代谢3.2.5

CRPPlac

因为没有很强的–35区和–10区保守顺序，Plac

启动转录的能力不强CRP（cAMPreceptorprotein）是与DNA结合后对转录起促进作用的调节因子（正调控）单纯因乳糖的存在发生去阻遏使lac操纵元转录开放，还不能使细菌很好利用乳糖，必需同时有CAP来加强转录活性，细菌才能合成足够的酶来利用乳糖仅当CRP

与cAMP（较高浓度）结合以后才起作用cAMP（浓度）由葡萄糖控制葡萄糖的代谢物抑制细胞内cAMP形成有葡萄糖时，细胞内cAMP低水平，CRP是无活性的二聚体，不能与DNA结合增强转录葡萄糖消耗殆尽，高水平的cAMP与CRP蛋白结合3.2.6

CAP位点CAP（cataboliteactivationprotein）：分解代谢激活蛋白cAMP-CRP+乳糖启动子DNA，用DNaseI去除未保护的碱基，得到CAP结合位点（CAPbindingsite）CAP位点在启动子Plac上游端，与Plac部分重叠CAP位点具回文序列特征双启动子假说体外转录分析不加cAMP-CRP的体外转录物有2种，分别是-22起始和+1起始启动子如果先加RNA聚合酶再加cAMP-CRP，从+1处起始转录，很慢启动子如果先加cAMP-CRP再加RNA聚合酶，从+1处起始转录，很快转录起始点，对应的是P1、P2（-35区）P1转录效率高，但与RNA聚合酶结合能力低P2转录效率低，但与RNA聚合酶结合能力高CRP调控模型当细胞没有cAMP-CRP时，RNA聚合酶优先与P2结合，低转录水平当cAMP-CRP与CAP位点结合时，RNA聚合酶与P1结合，转录效率高但实际上活体内并无P2转录物CRP是正调控，与CAP位点结合时，可增强RNA聚合酶的转录活性，使转录提高50倍正控制（positivecontrol）：CAP蛋白负控制（negativecontrol）：阻遏物lac

操纵子转录控制区lac操纵元的强诱导既需要有乳糖的存在又需要没有葡萄糖可供利用。通过这机制，细菌是优先利用环境中的葡萄糖，只有无葡萄糖而又有乳糖时，细菌才去充分利用乳糖细菌对葡萄糖以外的其他糖（如阿拉伯糖、半乳糖、麦芽糖等）的利用上也有类似对乳糖利用的情况，在含有编码利用阿拉伯糖的酶类基因群的阿拉伯糖操纵子（araoperon）、半乳糖操纵子（galoperon）中也有CAP结合位点，CAP也起类似的正性调控作用3.3CRP在gal操纵子中作用cAMP-CRP对gal操纵子的转录有激活作用（与lac操纵子相同）E.Coli的突变型cya-：cAMP环化酶缺陷crp-：CRP蛋白缺陷不能利用乳糖但可以利用半乳糖作为唯一碳源gal操纵子有两个启动子，分别对应的转录起始点是S1（+1）、S2（-5）有cAMP-CRP时，激活P1抑制P2，转录物从S1开始没有cAMP-CRP时，转录物从S2开始突变分析半乳糖启动子的一个突变型不能利用半乳糖，但它再突变为cya-或crp-，又能利用半乳糖了突变发生在p1处，聚合酶无法从S1起始同时cAMP-CRP又抑制p2的转录，也无法从S2起始当cya-或crp-突变，p2抑制解除，转录从S2起始，于是又能利用半乳糖了序列分析结果：-11位A→Tgal双启动子的功能gal不仅作为能源和碳源，还是细胞壁的组成部分UDP-半乳糖是直接前体在不含半乳糖的培养基上，细胞须有一定量的差向异构酶UDP-葡萄糖→差向异构酶→

UDP-半乳糖。以葡萄糖培养时，无cAMP-CRP，P2启动，产生少量的酶以半乳糖培养时，cAMP-CRP浓度增加，抑制P2而促进P1启动，保证细菌在两种不同的环境中都能生长3.4多操纵子调控全局调控（globalregulation）原核生物通过阻遏物或激活物的作用，通过许多单一的调节线路交织成一个复杂的调控网络，在转录水平上对操纵子进行调控，以便生物对外界环境的压力做出全面的适应性反应3.4.1调节子调节子（regulon）：受一种调节蛋白控制的一个或几个操纵子构成的调节系统一个调节子中的操纵子都属于同一代谢途径E.Coli麦芽糖调节子2个操纵子：malA、malB1个调节基因：malT3.4.2全局调节子全局调节子（globalregulon）：由一种调节基因/蛋白控制几个不同代谢途经的操纵子如cAMP-CRP对不同糖分解的调控SOS反应热激活（heatshock，放到后面讲）3.5色氨酸（Trp）操纵子和弱化作用含5个编码色氨酸（tryptophan）合成相关酶的结构基因Otrp下游编码一信号序列（前导区）仅当细胞色氨酸的供应短缺时，这些基因才被一致表达3.5.1结构基因3.5.2阻遏物和Otrp阻遏物由远离的操纵子trpR编码，与Otrp特异结合Otrp含有一长18bp的回文序列，位于-21和+3，与Ptrp序列重叠trp阻遏物仅当与Try组成复合物时才能与操纵基因Otrp结合，因此色氨酸是共阻遏物（co-repressor）Try作为终产物抑制自身的合成叫反馈抑制（feedbackinhibition）3.5.2阻遏表达阻遏物（二聚体）与Otrp结合，阻遏表达至少70倍3.5.3与阻遏不同的弱化作用色氨酸饥饿的E.coli加入色氨酸后，转录起始受阻，已经开始的转录也受阻trp-tRNA的浓度调节trp操纵子的表达trpR+trpS+：trp-tRNA合成酶活性trpS-：温度敏感突变型trpR+trpS+/trpR+trpS-：分别在30℃、42℃，含trp培养，分析Asase比活力上述结果显示了trp-tRNA的类似阻遏作用弱化作用与阻遏作用比较弱化作用（Attenuation）也属负调控，是辅助阻遏作用的一种精细调控

阻遏作用弱化作用调节强度>708～10mRNA全/无全/不完整作用位点OtrptrpL3.5.4前导区与弱化前导区（leaderregion）：操纵子（或单个结构基因）中开始转录到结构基因编码开始位置之间的一段DNA前导区缺失分析：trp∆LD102:trp∆ED53:trpa-/trpa+：比值显示前导区对转录的类似阻遏作用（见后表）前导区和阻遏物的差异品系trpR+trpR-trpR-/trpR+trp∆ED530.1711.869trp∆LD1021.3210076顺式作用分析阻遏作用：trpR通过基因产物（阻遏蛋白）以反式方式而发生作用前导区：只作用于同一条染色体的结构基因而不能作用另一条染色体上顺式、反式作用分析：染色体上trpL缺失对质粒上带有trpL的色氨酸基因表达的影响实验前导区缺失株的顺式效应trpR-株比活力ASase（trpE）TSaseα2（trpA）trp+1.414.8trpΔA561.10.26trpΔE5016.5trpΔLC1415096.0trpΔE5/colVBtrpΔA562.717.0trpΔLC1415/colVBtrpΔA562.51023.5.5前导区的一级结构162bp（trpE起始密码子前）可以表达前导肽（leaderpeptide）有有效的核糖体结合位点（SD序列，核糖体足迹）前导区27-68编码14aa的多肽，其中第10、11位都是trp密码子，稀有（E.coli蛋白质中色氨酸的平均含量约1/100）有高效的ρ非依赖型终止子，GC丰富的茎环和8个连续的U，如果转录时形成发夹，仅产生140bp的转录本重组分析：trpL+LacI→i大细胞实验（maxicell）DNA修复缺陷突变和重组缺陷突变的E.coli，在受到紫外线照射时染色体DNA严重损伤并降解。可是细胞中的质粒没有被紫外线击中而继续复制，由这些质粒编码的蛋白质继续合成trpL重组质粒→转化Ecoli大细胞株→紫外照射6h→标记培养→电泳检测有14肽的合成氨基酸饥饿表达各种氨基酸缺陷型→非饥饿培养

→洗净

→饥饿数分钟

→3H-U标记→杂交检测前导肽中各氨基酸饥饿，检测trp操纵子的mRNA量3.5.6前导区的二级结构推测链的配对区RNaseT1不完全酶切→非变性胶→变性胶前导区RNA的RNaseT1酶解片断非变性胶变性胶核苷酸大小（Nt）切点位置AA11~140不切或切在70－71A271~140A31~70BB1107~140107-108CC151/52~9551-52/52-5370-7195-96C271~95C351/52~70前导区的可变结构前导区含4个互补的区域（链1－4）4条互补链可以形成可变的发夹结构，其中之一是弱化子（attenuator）热力学分析的最稳定结构：链1与链2配对，链3与链4配对核糖体的状态影响前导区转录物的结构3.5.7弱化作用的普遍性存在前导区→可以翻译为前导肽前导区富含编码相应氨基酸的密码子前导区能形成可变的茎-环二级结构前导区的突变trpL29：AUG→AUA，增强终止His的突变分析hisO1242：组成型突变，E、F缺失hisO9654：赭石突变，CAA→UAA，缺陷型突变His-hisO9663：C/G→A/G，缺陷型突变His-

，配对功能丧失hisO9663：琥珀突变UAG，琥珀抑制基因，翻译到E区UGA（适合野生菌）融合质粒（hisL+lacZ）→带琥珀抑制基因/不带琥珀抑制基因→酶活力提高3倍以上3.6σ因子指导的调控σ因子：双功能蛋白（bifunctionalprotein）与RNA聚合酶的核心酶结合识别特定的启动子区域（-35和-10）很多细菌能够产生不只一种的σ因子，以应付不同生长环境下对转录调控的要求E.coli:热激活（Heatshock）bacillussubtilis（枯草芽孢杆菌）

：芽孢形成（Sporulation）由σ因子控制SPO1噬菌体σ因子组成级联反应3.6.1热激反应从30ºC转到42ºC培养15秒，产生17种新蛋白继续升高温度到极端（43~47ºC），E.coli只生产这些热激活蛋白以维持生存热激活蛋白（hightemperatureproductionproteinHTP）htpR-不再合成HTP蛋白，htpR的大小是32kd

32

又称为

H

，由rpoH编码

32

有自己特殊的启动子保守序列最普通的因子是

70

32和

70因子识别序列

保守序列

-35sequence-10sequence

标准

70

热激活

32

---------------TTGACA-----16~18bp---TATAAT

--T--C--C---CTTGAA--13~15bp--CCCCAT--T3.6.2

芽孢形成由σ因子控制营养生长期末，对数生长停止，触发芽孢形成复制的基因组DNA附在细胞的一端，隔膜（septum）形成产生两个独立的区域（不对称分裂），分化为母细胞（mothercell）和前芽孢（forespore）一条染色体全部进入前芽孢中前芽孢形成芽孢（spore），母细胞被溶解，芽孢释放芽孢形成过程中，芽孢特异性基因表达，生长期基因部分关闭。基本的调控发生在转录水平

因子的调控调控原则是每个区域（compartment）中新的

因子不断被取代，导致一系列不同基因被转录区域间的交流协调前芽孢和母细胞的时相性普通因子是

43（

A）转录出

F

，

H转录出前体

E。在隔膜形成前产生，无活性

F和

E分别转录前芽孢和母细胞中的基因前芽孢中

F通过磷酸化途径激活，芽孢形成开始

F激活调控一：表达前芽孢早期基因（含

G），由

G表达前芽孢的晚期基因

F激活调控二：通过膜结合蛋白激活母细胞中前体

E母细胞中

E被

K置换，表达母细胞的晚期基因3.6.3

因子组成级联反应很多噬菌体可以合成自身的

因子接管宿主菌的转录机器芽孢杆菌的噬菌体SPO1（烈性噬菌体）表达级联的（cascade）

因子，分别用来表达噬菌体的早期、中期和晚期基因噬菌体SPO1早期表达

28（gp28），诱发中期基因表达

33\3428基因突变，中期基因不再表达

33\34再次诱发晚期基因，使宿主RNA聚合酶顺序性（squentialorder）表达噬菌体基因33、34基因突变，晚期基因不再表达宿主细菌的全酶识别早期启动子早期基因表达28σ33\34表达噬菌体的晚期基因σ28取代细菌的σ因子识别中期基因中期表达33和34取代σ28第四章 噬菌体策略

Phagestrategies

一些概念噬菌体（bacteriophage）：感染细菌的病毒（virus）噬菌斑（plaque）：噬菌体裂解宿主细胞的斑裂解感染（lyticinfection）：细菌被噬菌体感染后致使细菌死亡并释放出子代噬菌体溶源（lysogeny）：噬菌体以原噬菌体形式成为细菌基因组中稳定的组分而继续存活原噬菌体（prophage）：噬菌体的基因组通过整合（integrate）成为细菌线性染色体的一部分免疫（immunity）：原噬菌体可以阻止同类其他的噬菌体感染同一个细胞诱导（induction）：原噬菌体通过诱导解除溶源化的限制1裂解周期（lyticcycle）有些噬菌体只有一种生存方式（strategy），在感染了一个易感宿主之后，破坏了宿主的功能而同时产生大量子代噬菌体颗粒，宿主细菌则裂解死亡一个典型的裂解周期中，噬菌体DNA（或RNA）注入宿主细胞，其基因以一定的顺序转录，并且复制出噬菌体的遗传物质，合成噬菌体颗粒需要的蛋白质成分。最后宿主细菌裂解而释放出组装好的子代噬菌体噬菌体颗粒（particle）感染（infection）附着（attach）DNA被注射进细菌早期发育（earlydevelopment）产生DNA合成酶类DNA复制开始晚期发育（latedevelopment）产生基因组、头、尾DNA包装进头，尾附着裂解（lysis）细胞破裂释放出子代噬菌体裂解发育的2个时期早期发育从噬菌体DNA进入到复制开始。主要合成与DNA复制相关的酶（DNA合成、重组和修饰的酶），导致基因组不断的复制和重组晚期发育从复制开始到细胞裂解释放出子代噬菌体。噬菌体颗粒的蛋白质成分被合成（结构蛋白和装配蛋白）噬菌体通常拥有保证使噬菌体DNA优先复制的功能基因（复制起始或新的DNA聚合酶）；噬菌体的mRNA被优先转录（改变RNA聚合酶的起始和终止能力或更换RNA聚合酶）噬菌体通常利用宿主的合成机器合成自己的蛋白质

裂解发育的基因表达早期基因（earlygene）：最初阶段必须依赖宿主转录机构表达的基因（λ噬箘体中为早早期immediateearlygene）中期基因（middlegene）获得早期基因编码的调控蛋白后表达的基因（或称迟早期delayedearlygene）晚期基因（lategene）中期基因编码的调控因子控制的基因裂解表达的级联控制噬箘体基因位置组成（遗传图谱）反映了裂解进程的次序，它的操纵子是一个极其有序的结构，编码相关功能蛋白质的基因成簇排列使得调控最为经济，使得裂解的进程能由少数的调控开关控制裂解周期受到正调控，噬菌体的基因只有接受到恰当的信号才被表达。在这个级联反应中，上个步骤合成的蛋白质将是下一个步骤要表达的基因所必须的在每个表达的阶段，一个或多个活跃的基因就是下个阶段所需的调节因子，这些调节因子可以是一种新的RNA聚合酶、改变宿主RNA聚合酶特异性的sigma因子、或是能使之通读的抗终止因子级联控制的2种途径转录起始：识别新的噬菌体启动子，用一种σ因子取代宿主酶的σ因子（spo1）或合成新的RNA聚合酶。新σ因子或RNA聚合酶生成后，早期基因表达可被终止抗终止作用：早期基因与下一期基因相邻，由终止位点隔开。如果终止作用被阻止，RNA聚合酶便通读至另一边基因，这样早期基因与晚期基因一起表达2溶源（lysogeny）另一些噬菌体有两种存在方式：裂解和溶源溶源的结果是原噬箘体整合到细菌基因组上，并与细菌基因一起遗传由于含有一个原噬箘体，溶源菌会对同样类型的噬箘体产生免疫，一个细菌基因组只包含一个拷贝的同一类型的原噬箘体有两种策略的噬菌体可以进行溶源和裂解生活周期的交替溶原和裂解的相互转化由裂解周期产生的一个噬菌体进入一个新的宿主细胞后，或者会重复裂解周期，或者进入溶源状态，这取决于感染的状态及噬菌体和细菌的基因型在诱导（induction）的过程中，原噬菌体被切除下来，从而脱离溶源生存方式约束获得自由，产生一个自由的噬菌体DNA，由此进行裂解旁路噬菌体以何种方式繁殖是由转录调节来控制的噬菌斑（plaque）最初一个噬菌体感染一个细胞，裂解释放的子代噬菌体又感染旁边的细胞，感染的连锁反应呈放射状分布，逐渐形成一个噬菌斑烈性噬菌体形成清晰的噬菌斑温和的噬菌体形成浑浊的噬菌斑3λ噬箘体的表达调控λ（lambda）噬箘体基因组：48502bp线性双链DNA两端有12碱基的粘性末端（cohesivecos），进入细胞后变为环状DNAλDNA环化后，晚期基因在转录时是完整的λ噬箘体基因组编码约35个蛋白质

λ噬菌体的操纵子早早期基因：PR、PL迟早期基因：PR、PL裂解晚期基因：PR、PL、PR’溶源晚期基因：PRE、PaQ、PI溶源维持基因：

PRM3.1

λ噬菌体的裂解途径λ噬箘体DNA进入一个新的宿主细胞后，裂解与溶源以相同的途径启动第一阶段是利用宿主的RNA聚合酶进行早早期（immediateearly）基因的转录λ噬菌体只有两个早早期基因，各自独立地由宿主RNA聚合酶表达λ噬菌体的裂解级联反应建立在抗终止作用基础上早早期基因的表达从启动子PR向右转录到tR1，可以表达

cro蛋白

cro蛋白有双重功能：抑制阻遏物的合成（对裂解进行是必需的）关闭早早期基因的表达（在裂解周期晚期已不需要）（cro在后面还要详细介绍）从启动子PL向左转录到tL1，可以表达

N蛋白pN是一个抗终止子，它作用在nut位点将允许转录过程进入迟早期基因从启动子

PR’向右转录到

tR’

，无任何编码序列抗终止（antitermination）抗终止作用提供了病毒控制从早期基因到下一期基因表达转变的一种机制抗终止作用依赖于基因位置的特殊安排：早期基因与接下来要表达的基因非常接近，由终止子隔开如果终止子位点被抑制，聚合酶越过通读另一边的基因，同样的启动子继续被RNA聚合酶识别新基因的表达只在于伸长RNA链，使之在5′端含有早期基因，在3′端含有新的基因抗终止是正控制，病毒必须先合成早期基因的产物，然后才能表达下一组基因抗终止依赖特定的位点λ

噬菌体的pN能分别解除终止子tR1

、tL1等的终止作用pN的抗终止作用是高度特异性的，但抗

终止事件并不是由终止子tR1

和tL1决定的抗终止作用的识别位点在转录单位的上游，是在与作用完成的终止子位点不同的其它区域

pN

识别位点：nut位点（Nutilizationsite）nutL、nutR分别决定向左或向右抗终止作用nut位点nutL在PL的起始点和N编码区域的开始之间，接近于起始子nutR位于cro基因的末端和tR1之间，接近于终止子qut位于起始子之前这个作用涉及rho-依赖性终止子的抗终止，但是pN也可抑制非依赖终止子的抗终止作用

PR迟早期基因表达从PR开始的迟早期（delayedearly）转录本表达转录一直到终止子tR3

，除了

cro外还有cII蛋白（溶源中重点介绍）O&P蛋白：噬菌体复制所必需Q蛋白：另一个抗终止因子，Q是晚期基因表达所必需的PL迟早期表达除了

N

蛋白，从PL

开始的早期转录本还表达：cIII、xis、int蛋白（后面溶源中介绍）裂解级联依赖抗终止早早期宿主RNA聚合酶从PL、PR起始转录N和cro迟早期pN允许转录越过N和cro后继续，产生pQ晚期从Q与S间的启动子PR’

开始，如果缺少了pQ，晚期转录将在tR3位点终止，转录产物194nt，为6SRNApQ出现后，抑制tR3的终止，6SRNA得以延伸晚期基因的转录不在特定点终止，持续转录所有晚期基因乃至走出这个区域晚期基因左端的转录时也有相似的情形，经过重组功能区后仍继续每个方向上进行的转录可能在聚合酶撞到一块前就终止了3.2λ噬菌体的溶源途径如果要在E.

coli

中建立溶源，λ噬菌体必需做到：合成阻遏物噬菌体整合到宿主染色体上既便噬菌体选择溶源途径，早早期基因的表达与裂解途径相同PR迟早期表达pN作用下的迟早期转录，从PR开始一直到终止子tR3表达cII（其他蛋白在裂解中起作用，前面已介绍）cII是溶源生长所需的转录激活因子，可以激活3个启动子：PRE、PaQ

和

PIcII不稳定，对蛋白酶敏感cIII能够保护cII防止其降解pN作用下的迟早期转录，从PL开始的转录表达cIII、xis、int（N蛋白不再介绍）cIII可以保护cII

蛋白cII单独存在的半衰期<1min；有cIII时的半衰期~5minXis一般认为是原噬菌体切除所必需的Int一般认为是前噬菌体整合所必需的值得注意的是，这里的xis和int由于sib位点的反向调节（retroregulation），并不表达出蛋白PL

迟早期表达反向调节（retroregulation）在pN作用下，由PL的转录越过终止子，形成了核酸酶的靶位点sibsib首先被RNaseIII剪切，接着核酸外切酶从3’→5’降解mRNAsib是int基因下游的负调节位点，降解由下游向上游进行，故称为反向调节sib突变是阻止了RNaseIII识别靶位点，rnc-的突变具同样效果由PI的转录在tI终止，具终止子结构的mRNA稳定，可以表达蛋白cII是溶源所必需的，没有或者量不够，λ都不能进行溶原生长cII是建立溶源所必需的，但维持溶源是不需要的细胞中cII的水平与宿主蛋白酶的水平相关HflA和HflB是两类消化cII

的蛋白酶（HighFrequencyofLysogenization）基因hflA座位实际上编码3个基因，其中HflC和HflK是消化cII

的蛋白酶HflB编码的蛋白酶可以消化cII和s32宿主细胞的蛋白酶水平与生长状态相关，营养丰富的细胞蛋白酶水平高，饥饿的细胞水平低与cII、cIII的基因剂量有关感染复数（multiplicityofinfection）10倍的细胞cII半衰期可以长40～50倍野生型的模糊噬菌斑由于不同的moi引起诱导的不可逆性是由于原噬菌体的一份基因不足以重新建立起溶原CII激活的转录PROMOTERSEQUENCEPRETTGC

GTTTGT

TTGC<--

13-->AAGTATPITTGC

GTGTAA

TTGC<--

13-->TGTACTPaQTTGC

GAGCAC

TTGC<--

13-->TAGTATconservedcIIbindingsitesareshowninred;-35sequencesareingreen;-10sequencesareinblue.保守的cII

结合位点TTGC突变，将影响噬菌体建立溶原的能力PRE晚期表达由cII激活的转录，从启动子PRE开始的转录直接表达cI细胞中有cI蛋白的积累，就可以通过与操纵基因OR的结合激活自己的启动子PRM因为从PRE

转录的mRNA与cro的mRNA（从PR转录）有一段反义（anti-sense）序列，由于编码区是双链RNA而导致cro不能翻译，这属于反义控制（Antisensecontrol）PRM和PRERE：repressorforestablishmentoflysogenyRM：repressorformaintenanceoflysogeny由PRM起始转录的mRNA缺少SD序列，翻译效率差由PRE起始转录的mRNA较长，有SD（Shine-Dalgarno）序列，翻译效果好，得到的cI蛋白量比由PRM启动得到的量多6～7倍PaQ晚期表达由于自我终止，从PaQ

开始的转录产物是一段短的60nt的反义RNA，用于调节

Q蛋白的表达它与PR的mRNA的核糖体结合位点（SD序列）互补，抑制Q蛋白的表达由PaQ、PRE启动的转录抵消（counteract）

cro和

Q

在推动裂解进程中的作用PI晚期表达由于PI位于xis的内部，从PI开始的转录终止于tI，只有

Int

蛋白能表达，适合噬菌体整合为原噬菌体，进行溶源化生长3.3λ噬菌体的表达调控调控区：λ基因组内与调控有关的基因和位点集中在cIII到cII范围内调控区内有4个启动子，PR、PL、PRE、和PRM与乳糖操纵子不同，λ噬菌体的启动子P与操纵基因O序列相互重叠，且有6个与阻遏物（cI和cro）结合的位点OR3、OR2、OR1；OL3、OL2、OL1PR与OR2、OR1重叠；PL与OL2、OL1重叠；PRM与OR2、OR3重叠每个操纵基因上3个位点和阻遏物的亲和力各不相同，这种差异对裂解或溶原途径起重要的作用操纵基因每个操纵基因由17bp组成，之间间隔3～7bp，间隔序列大多为A/T6个序列相似，都表现一定程度的回文对称性烈性突变（方框中的突变）减弱了回文对称性，减弱了与cI的亲和力合成的参考序列，有绝对的回文对称性，具最大的亲和力操纵基因突变操纵基因突变减弱对称性的突变→结合cI的能力弱→溶原性弱→烈性噬菌体增强对称性的突变→结合cI的能力强→溶源性强→温和噬菌体间隔区突变OR3与OR2之间，

cI基因上游第33个碱基对：C/G→T/A，造成PRM启动功能缺陷OL2与OL1之间，

N基因上游第31个碱基对：C/G→T/A，破坏了PL的启动功能都发生在间隔区唯一的C/G对上调节蛋白cI、cII和cIII野生型的噬箘体感染，其噬菌斑浑浊而不透明，因为其中包含了一部分溶源未裂解的细胞cI基因突变的结果会阻止溶源，因此噬菌斑只含有裂解的细胞，感染产生了透亮的噬菌斑（clearplaque，c），基因cI、cII和cIII就是由于他们所涉及的表型而得名cro

蛋白controlofrepressorandotherthings各种λ噬箘体突变型的溶原化频率菌种溶原化频率

+～4×10-1cI<10-5cII10-5~10-4cIII10-2~10-1cI蛋白是阻遏物cI基因突变→宿主不被溶源化→说明cI的作用是阻遏λ噬菌体的活动（与lacI相似）cI的作用不但阻止原噬菌体活动，也阻遏继续感染的λ噬菌体的活动（免疫性）→具反式功能→蛋白cIts在低温（30℃）保持溶原，在高温（42℃）裂解生长，说明cI产物对温度敏感→蛋白质cI产物作用在λ噬菌体的特定位点λimm434、λimm21的免疫区被取代，可以在溶原化的细菌中复制繁殖cI蛋白是专一性的，一种噬菌体的阻遏蛋白只作用它本身的免疫区cI蛋白的结构cI蛋白是一种酸性蛋白，由2个相同的亚基组成cI蛋白每个亚基236aa，两端各有一个结构域（domain）N端富含赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）(9/26,35%)，与操纵基因结合C端不但聚合为二聚体，并且能使两个二聚体缔合cI蛋白结构分析遗传学分析生化分析遗传学分析基因内互补实验：一种λ

cIts先在34℃感染→获得溶原化细菌→再用另一种λ

cIts去感染→再在42℃培养→观察是否裂解互补：不裂解不互补：裂解在N端的突变型和在C端的突变型能够互补同在N端或同在C端的突变型不能互补生化分析用木瓜蛋白酶水解cI蛋白，水解点集中在75～150氨基酸位置，N端和C端都不被水解，说明这两个区域折叠起来甲基化分析cI蛋白/N端片段＋DNA→用硫酸二甲酯处理→嘌呤甲基化→（六氢吡啶溶液中）甲基化的嘌呤断裂，而蛋白保护的DNA片段不断裂N端片段与操纵基因结合的部位和完整cI蛋白与操纵基因结合的部位一样分子量测定：C端片段可以聚合成为低聚物而N端片段不能聚合cI蛋白对操纵基因的保护1.OR1DNA中加入cI蛋白的N端2.OR1DNA中加入完整的cI蛋白3.OR1DNAcI与操纵基因的结合DNA(野生型或突变型)OR3OR2OR1OR+2521OR1-55-OR2-25-2OR1-OR2-25--OR1-OR3--25-cI蛋白N端与操纵基因的结合DNA(野生型或突变型)OR3OR2OR1OR+25251OR1-2525-OR2-25-1OR1-OR3--25-cI蛋白与3个操纵基因亲和力：OR1>OR2≥OR3邻近位点上的cI蛋白二聚体由于缔合作用而有协同效应cI蛋白的N端片段不具有协同效应cI蛋白与操纵基因亲和力cro蛋白的结构和功能有66个氨基酸残基cro蛋白与cI蛋白无序列同源性，但功能相似：以二聚体形式和操纵基因结合cro蛋白也能和OR1、OR2、OR3三个位点结合和cI蛋白结合力下降的突变和cro蛋白的结合力也下降cro蛋白与3个操纵基因亲和力：OR3>OR2≥OR1没有协同效应cro蛋白与操纵基因的结合DNA(野生型或突变型)OR3OR2OR1OR+188OR1-18-OR2--8OR1-OR3--8-cro和cI对转录的影响cro蛋白对cI基因和cro基因的转录都起负控制作用cI蛋白对cro基因的转录起负控制作用；对cI基因本身的转录既有正控制又有负控制cro蛋白和cI蛋白相互竞争、相互制约，λ的调控存在于这两种蛋白的相互作用中融合操纵子技术构建融合操纵子质粒lac

I的产物阻遏cI的表达将质粒转化到特定的溶原性E.coli中由l

ORPRM

启动的lac

Z培养基中加入诱导物-IPTG质粒表达的cI蛋白对由ORPRM启动的lac

Z产生影响测定β-半乳糖苷酶的活力可以衡量这种影响把PRM换成PR

，可以研究cI蛋白对PR的影响把cI换成cro，可以研究cro蛋白对PRM、PR的影响

cI和cro对PRM、PR的影响