PCR扩增技术培训课件

DNA聚合酶引物引物M13噬菌体Sanger的测序技术引物DNA聚合酶1PCR扩增技术8/23/2024引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2PCR扩增技术8/23/202494℃变性50-65℃退火XX℃延伸3PCR扩增技术8/23/2024Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)405060708090100100806040204PCR扩增技术8/23/202472℃94℃55℃PCR循环5PCR扩增技术8/23/2024一、PCR的基本原理

PCR技术实际上是DNA的体外扩增技术。其原理类似于DNA在体内的复制过程。只要提供一个合适的条件――模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、四种dNTP原料和合适的缓冲液体系，在一定的温度下，经过重复的过程，就可以完成DNA的体外合成。PCR反应是一个重复进行的DNA复制过程，需要重复进行：模板的解链、引物与模板的结合（粘合）、DNA聚合酶催化新链DNA的合成。6PCR扩增技术8/23/2024这些过程都是通过控制温度来实现的，即通过改变温度引起变性（denature）、退火（annealing）和延伸（extension），使DNA得以复制。1、变性通过加热至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，作为反应的模板。2、退火将温度降至引物的Tm值左右或以下（比Tm低5℃，通常为55～65℃），引物与DNA模板互补结合，形成杂交链。7PCR扩增技术8/23/20243、延伸在DNA聚合酶（一种耐热的DNA聚合酶）的作用下，于70～74℃以引物3′端为起始点按5′→3′方向使DNA新链延伸。

上述三步为一个循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此经过25－30个循环，可使新生的DNA片段得以扩增106－9倍（至少扩增105

倍）。PCR的反应原理也就是PCR的基本过程。

8PCR扩增技术8/23/20241234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍9PCR扩增技术8/23/2024复性（退火）10PCR扩增技术8/23/2024延伸11PCR扩增技术8/23/2024变性12PCR扩增技术8/23/2024复性（退火）13PCR扩增技术8/23/2024延伸14PCR扩增技术8/23/2024变性15PCR扩增技术8/23/2024

复性（退火）16PCR扩增技术8/23/2024延伸17PCR扩增技术8/23/20241）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。PCR反应条件18PCR扩增技术8/23/2024（2）引物浓度

0.1-0.5mol/L

浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-2.5U/50l

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。19PCR扩增技术8/23/2024（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量

dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。20PCR扩增技术8/23/2024（5）Mg2+

Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。21PCR扩增技术8/23/20242）循环参数变性使双链DNA解链为单链

95oC20-30秒(2)退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。22PCR扩增技术8/23/2024（3）延伸

70-75oC，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低