第三章 DNA复制 课件

第三章DNA复制

(DNAReplication)第三章-1DNA复制图第一节基本概念

第二节DNA复制的酶学

第三节原核生物DNA复制（E.coli）

第四节真核生物DNA复制第五节DNA的损伤修复及突变第三章-1DNA复制图DNA复制在细胞周期的S期第三章-1DNA复制图一、DNA的半保留复制（Semi-ConservationReplication）1958Meselson-stahl设计的CsCl超离心试验证实了

DNA复制的这一特性（P39）第一节基本概念第三章-1DNA复制图15N标记实验·细胞生长在15N标记培养基中·转入正常N源培养基中·分离各代DNA·分析各代DNA的浮力密度15N标记DNA未标记DNACsCL密度梯度离心浮力密度

N15－DNA1.742g/mlN15－N14－DNA1.717g/mlN14－DNA1.710g/ml第三章-1DNA复制图第三章-1DNA复制图ReplicationforkP40第三章-1DNA复制图1、复制起点：富含AT&发夹结构“呼吸作用”十分明显许多酶的结合位点ATrich第三章-1DNA复制图复制叉（replicationfork）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点

2、复制方向（复制过程的顺序性）

复制眼（replicationeye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛第三章-1DNA复制图真核生物的多复制子多个复制眼第三章-1DNA复制图单、双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉

单向复制

双向复制第三章-1DNA复制图

复制的多模式单起点、单方向（原核）多起点、单方向（真核）单起点、双方向（原核）多起点、双方向（真核）第三章-1DNA复制图

（1）θ复制：DNA在复制原点解开成单链，分别作为模板，各自合成互补链，出现2个叉状的生长点第三章-1DNA复制图（2）共价延伸方式（covalenceelongation）或滚环式复制（rollingcirclereplication）由于复制时产生的滚环结构形状象σ，又称σ复制

病毒、细菌因子

第三章-1DNA复制图

（3）置换式（Displacementform

）又称D环复制

动物线粒体

DNA的复制方式第三章-1DNA复制图第二节参与DNA复制的酶(P47)第三章-1DNA复制图

其中DNApolⅢ

全酶有十种共22个亚基β二聚体－－滑动钳第三章-1DNA复制图第三章-1DNA复制图DNApolⅠ和DNApolⅢ的主要特性和功能（P47）1、DNA聚合酶活性：两者都有条件－－模板、引物

DNApolⅠ－－主要用于DNA

的修复和RNA引物的替换能填充很大的缺口，甚至整个互补链

DNApolⅢ－－DNA链的延长填充几个碱基的小缺口

第三章-1DNA复制图2、3’－5’外切核酸酶活性

校对功能(proofreading)第三章-1DNA复制图第三章-1DNA复制图

3、5’－3’外切核酸酶活性

DNApolⅠ的5’－3’外切活性有以下三个特点：

♦必须有5’－磷酸末端♦被除去的核苷酸必须是已经配对的♦被除去的可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核糖核苷酸（缺口平移）第三章-1DNA复制图缺口平移(nicktranslation)指在DNA分子的单链缺口上，DNAPolI的5’--->3‘核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5，端移去一个核苷酸之后，聚合作用就会在缺口的3，端补上一个新的核苷酸，但由于DNAPolI不能在3，-OH和5，-P之间形成一个键，因此随着反应的进行，5，端核苷酸不断地被移去，3，端核苷酸又按序增补，于是缺口便沿着DNA分子合成方向移动。

第三章-1DNA复制图第三章-1DNA复制图DNA复制保持准确性的机制:1、碱基互补配对2、复制酶的校对机制3、复制的起始具有引物：避免由于最初几个核苷酸的复制错误导致的致死突变!!!4、从5’到3’延伸5、生物体的DNA修复机制第三章-1DNA复制图第三节原核生物DNA复制第三章-1DNA复制图DNA拓扑异构酶既能水解，又能打断碱基互补配对的氢键拓扑酶Ⅰ切断DNA双链中的一股拓扑酶Ⅱ切断DNA双链

解链酶利用ATP解开DNA双链单链DNA结合蛋白（SSB）维持模板处于单链状态保护单链的完整引物酶是RNA聚合酶，合成一段RNA引物

第三章-1DNA复制图

拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。拓扑异构酶Π：使DNA两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，同复制有关。第三章-1DNA复制图第三章-1DNA复制图第三章-1DNA复制图几乎所有天然状态的双链DNA均以负超螺旋的方式存在，许多实验证明，负超螺旋是DNA复制的必需条件，因此DNA旋转酶（原核生物）也是复制所必要的，负超螺旋的存在有利于DNA的双链分开。第三章-1DNA复制图第三章-1DNA复制图第三章-1DNA复制图复制的引发(P46)前导链的引发：RNA聚合酶滞后链的引发：引发前体＋引发酶＝引发体第三章-1DNA复制图引发体(primosome):

是由DnaA、DnaB、DnaC以及其他复制因子一起形成复合体，再结合引物酶（DnaG）形成较大的聚合体，结合到模板DNA上。第三章-1DNA复制图引物酶(primase):

依赖DNA的RNA聚合酶

催化RNA引物的合成

在大肠杆菌，引物酶是dnaG基因的产物RNA引物：在DNA模板的复制起始部位由引物酶催化NTP的聚合，形成短片段的RNA，为DNA

聚合提供3´-OH末端。第三章-1DNA复制图实际上，两种类型的引物合成是在不同的DNA分子状态下进行的。前导链的引物合成需要引发DNA双链；而滞后链的引物合成是在已经解链的状态下进行的。可能在大多数情况下，两种类型的引物合成都是由引物酶合成的，RNA聚合酶的作用是通过转录解开局部DNA双螺旋。第三章-1DNA复制图第三章-1DNA复制图一个复制叉的诞生，关键是前导链合成的起始；前导链合成起始的关键又是引物的产生；引物产生的关键又是转录激活，也就是RNA聚合酶将复制原点的DNA序列转录成一系列长度不等的RNA短链。至于转录激活所产生的RNA能否作为引物来引发前导链的合成，至今无定论。第三章-1DNA复制图OriCinE.colichromosomalDNA

oriC与E.coli

复制的起始（P44）♦四个9bp的重复序列

dnaA结合位点♦三个13bp的重复序列若干GATC位点第三章-1DNA复制图起始的过程打开DNA超螺链打开双螺旋防止复螺旋单链结合蛋白解链酶引物复合体引物酶拓扑异构酶合成第三章-1DNA复制图复制起始1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、DnaA蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白（HU、ATP参与下,DanA蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4、DnaB借助于水解ATP产生的能量在DnaC的帮助下沿5’→3’方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（DnaG蛋白）开始合成RNA引物。起始复合物前引发复合物开链复合物第三章-1DNA复制图复制叉的移动方向解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引发体DNA聚合酶ISSB3´3´5´前导链滞后链3´5´复制的起始DNA链的延长DNA链终止5´RNA引物3´3´半不连续复制过程

第三章-1DNA复制图复制体第三章-1DNA复制图专一性终止蛋白

E.coli

中由tusgene

编码（terminusutilizationsubstance）通过抑制DNA解链酶而发挥终止作用每次复制时只使用一个终止位点ter第三章-1DNA复制图第三章-1DNA复制图前导链合成是连续的，滞后链合成是不连续的；前导链上的DNA聚合酶Ⅲ全酶和滞后链上的引发体具有很高的进行性，即不与DNA模板链解离，保证了前导链和滞后链复制的迅速进行；前导链的合成总是领先一段，但没跑太远，总是与滞后链保持相对稳定的一段距离。第三章-1DNA复制图

第四节真核生物的DNA聚合酶（P48）

α、β、δ、ε、γ五种

位置核内核内核内核内线粒体

合成

与引发修复合成合成,修复复制功能酶结合

前导链后随链3’－5’校NONOYesYesYes正活性

α

β

δ

ε

γ第三章-1DNA复制图真核和原核DNA细胞复制比较第三章-1DNA复制图真核生物DNA复制与原核生物DNA复制的不同（P47）：第三章-1DNA复制图第五节DNA损伤、修复和突变概述：损伤因素及其类型复制过程中的错配修复损伤修复第三章-1DNA复制图第三章-1DNA复制图

广义的修复系统：♦DNA聚合酶的校对功能(复制的范畴)♦错配修复♦碱基切除修复（尿嘧啶-N-糖苷酶修复系统）♦核苷酸切除修复♦直接修复(光复活、重组修复、SOS修复等)第三章-1DNA复制图★错配修复(P50)DNA中的GATC为m6A甲基化敏感位点平均每2kb左右有一GATC

第三章-1DNA复制图

甲基化程度的差异MutL/MutS扫描识别错配碱基和邻近的GATC序列切点－－甲基化GATC中

G的5’侧DNAhelicase,SSB,exonucleaseI去除包括错配碱基的片段DNApolymeraseIII和

DNAligase填充缺口昂贵的代价用于保证DNA的准确性修复过程第三章-1DNA复制图第三章-1DNA复制图碱基切除修复(P51)尿嘧啶-N-糖苷酶系统(ungsystem

)修复尿嘧啶的来源：dUTP的渗入胞嘧啶的自发脱氨氧化第三章-1DNA复制图---TAGC------ATCG------TAGC------ACG---U---TAGC---尿嘧啶-N-糖苷酶

①GCUAU---TAGC------ACG---AP内切酶(Apurinase)②---TAGC------ATCG---DNApolІLigase

③第三章-1DNA复制图★核苷酸切除修复(P54)

第三章-1DNA复制图第三章-1DNA复制图PR1、光复活（photoreactivation）----TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA----

复制前修复、不容易出错400nm蓝光、PR酶

(photo-reactivationenzyme)

光敏裂合酶（photolyase）可见光激活二聚体修复的机制：第三章-1DNA复制图2.切除修复Exision—Repair

复制前进行不易出错UvrA,B,Cgen