2012313-加减一阴煎对血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖影响

1/12012313_加减一阴煎对血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖影响加减一阴煎对血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖的影响中山大学医学部临床医学系2001级郑跃陈惠国罗杰鸿摘要目的：

探讨中药制剂加减一阴煎对培养的血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖的影响及其机制。

方法：

以中药复方水煎液对新西兰大白兔灌胃一周，在无菌条件下取血制备血清药，在培养血管内皮和平滑肌细胞中加入不同剂量的血清药，通过细胞计数研究药血清对它们增殖的影响及其机制。

结果：

与空白组和纯血清组对比，平滑肌细胞数目减少，内皮细胞数目大幅度增加，并有剂量依赖性。

结论：

加减一阴煎对血管平滑肌细胞增殖有一定的抑制作用，而对血管内皮细胞有触增殖的作用。

关键词加减一阴煎血管平滑肌细胞血管内皮细胞血清药研究表明许多植物中含有植物雌激素，如异黄酮、－谷甾醇等，它们既有拟雌激素样的作用，同时还具有心血管保护作用，以明代《景岳全书》中名方一阴煎为主方的加减一阴煎主要由生地、熟地、白芍、麦冬、黄精、知母、地骨皮、牛膝和炙甘草组成，滋阴补血，活血逐瘀的功效，用于治疗治疗妇女的月经不调的疾病，现代有人将它用于中药人工周期来治疗卵巢功能早衰继发性闭经[1]，表明加减一阴煎具有恢复卵巢功能的作用，具有拟雌激素样的作用。

而加减一阴煎是否具有心血管保护作用还未见报道。

因此本实验从从中医养阴补血理论出发，运用生理、生化和分子生物学的方法从细胞水平探讨加减一阴煎抗AS的机制，使之能对绝经期妇女AS防治有所帮助。

材料与方法一材料1．动物：

健康成年新西兰大白兔(2.0-2.5kg)和SD大鼠(150-250g)均由中山大学医学部动物实验中心提供。

小牛主动脉内皮细胞，由广州市奶牛研究所提供。

2．主要药物和试剂：

加减一阴煎（主要由生地、熟地、白芍、麦冬、黄精、知母、地骨皮、牛膝和炙甘草组成），胰蛋白酶，血管紧张素Ⅱ、PBS溶液、无血清的DMEN和含血清含DMEM培养液、3.主要实验仪器:CO2培养箱（德国HERAEUAS）二台，Revco超低温冰箱一台，冷冻离心机（德国EPPENDORF）一台，超净工作台二台，倒置显微镜一台，各种水浴箱，天平，自动煎药煲和普通冰箱二方法(一)药血清的制备方剂成分的含量：

生地15g、熟地20g、白芍15g、麦冬15g、黄精15g、知母15g、牛膝15g、丹参15g、川芎15g、地骨皮12g、和炙甘草6g。

每剂药加水750ml并煎至250ml。

选择健康成年新西兰大白兔，每天用中药复方水煎液定时灌胃二次，每次60ml，持续一周.最后一次灌胃后2小时，在无菌局麻条件下行兔颈总动脉插管放血，离心取血清，56℃、30min灭活补体，4℃保存备用。

对照组灌等量生理盐水，同法制备对照血清。

(二)研究药血清影响VSMC增殖的方法1.VSMC的培养利用组织块贴壁法进行VSMC培养.取150-250g大鼠,颈椎脱臼法处死,迅速打开胸腔,无菌条件下取出胸主动脉,放入无菌的PBS平衡液中,清除血块和外周结缔组织,去除内皮,用眼科剪剪成1mm3组织块,均匀分散于培养瓶中,放入37oC二氧化碳培养箱孵育,待组织块贴壁后,加入含20%小牛血清的无酚红的DMEN液中继续培养,七天后细胞从组织块边沿长出,待细胞张满瓶底后可传代.倒去培养液,用PBS洗涤,加入0.125%的胰蛋白酶于37oC消化细胞,倒置显微镜下观察,待细胞收缩变圆,立即倾倒消化液,加入含10%小牛血清的无酚红的DMEN液终止反应,1:2的比例进行分瓶传代.实验用4-6代细胞.2.加入药血清培养和细胞计数VSMC以4X105个细胞/ml密度0.5ml接种于24孔板,当细胞长至亚融合状态,用无血清DMEM液培养24h;加入不同浓度的药血清及对照血清,1h后加入终浓度为10-7mol/L的血管紧张素Ⅱ,培养18h,倒去培养液,用PBS洗涤,加入0.125%的胰蛋白酶于37oC消化细胞,倒去胰酶,加入0.5mlPBS,吹打使全部细胞悬浮,用滴管滴入计数板,计数.每孔细胞数目=每计数板细胞50003.实验分组分为三组：

空白组Ⅰ；对照组Ⅱ(每孔加10-50ul的对照血清)；药血清组（分别加：

10ul、20ul、30ul、50ul、80ul、100ul、120ul和150ul药血清）。

每组设4个复管.(三)研究药血清影响血管内皮增殖的方法1.新生小牛主动脉内皮细胞(BAECs)的培养和细胞计数在无菌条件下取新生小牛胸主动脉,按常规方法分离,培养BAECs,原代BAECs呈铺路石状,Ⅷ因子染色阳性.实验采用传代培养第3-5代的细胞,培养液为含100ml/L小牛血清的无酚红的DMEN,处理前24h换用无血清加入转铁蛋白等补充营养的无酚红的DMEN.每孔细胞数目=每计数板细胞50002.实验分组血管内皮细胞以3105个细胞/ml密度0.5ml接种于24孔板，分为三大组：

空白组Ⅰ；对照组Ⅱ（每孔加不同量的对照血清）；药血清组Ⅲ（10ul、20ul、30ul、50ul、80ul、100ul、120ul和150ul八个药血清）。

每组设6个复管。

四统计学处理：

所有数据均以meanSD表示,组间及组内均数的比较用方差分析(ｑ检验)。

结果一药血清对VSMC增殖的影响：

图一示与空白组和对照组比较，不同量的药血清对VSMC增殖有一定的抑制作用，并有一定的剂量依赖性，抑制作用的最适浓度为80ul。

当药血清量80ul时，其抑制作用呈降低趋势。

图一：

药血清对VSMC增殖的影响(10ul药血清组P0.05,其余组P0.05)二药血清对血管内皮细胞增殖的影响：

图二示与对照组相比，药血清对血管内皮细胞有明显的触增殖作用，有一定的剂量依赖性，在30ul增殖最强。

{触增殖率=（每个剂量的计数结果－空白组计数结果）/空白组计数结果}平滑肌细胞计数结果010203040506070空白对照1020405080100120150药血清量(ul)细胞数(5000)中药触发内皮增殖对照组(104)对照组触增率药血清组(104)药血清组触增率10ul13.331.080.8216.584.341.2620ul23.001.702.1438.177.104.2330ul23.672.272.2333.003.833.5050ul10.921.460.4933.754.223.6280ul18.251.720.9237.674.272.96120ul24.921.391.6241.587.613.38150ul24.583.011.5948.422.224.10图二中药触发内皮增殖讨论研究表明雌激素具有广泛的心血管保护作用雌激素可保护内皮功能和抑制血管平滑肌细胞的增殖[1，8]，临床上使用雌激素替代疗法可有效的减少绝经期妇女的AS的发病率。

但雌激素的长期使用但也会带来如子宫内膜癌和乳腺癌等严重副作用。

如何在发挥雌激素的保护作用同时，减少它的副作用是急需解决的问题。

目前临床上用于治疗AS的中药方剂主要集中药触发内皮增殖012345671020305080120150加入血清（ul)增殖率药血对照中在活血化瘀药和里气、补气药上[2]，而对养阴补血方面研究甚少。

对于广大绝经期妇女而言，往往有阴虚内热之症，加减一阴煎主要通过其滋阴补血的功效来治疗治疗妇女的月经不调的疾病，现代有人将它用于中药人工周期来治疗卵巢功能早衰继发性闭经[3]，这种类似雌激素的作用对临床上使用雌激素替代疗法来抗AS是一个很好的补充，可通过与加减一阴煎的合用来减少雌激素的用量，这对缓解雌激素的副作用大有裨益，有助于广大绝经期妇女AS的防治。

同时通过对加减一阴煎的作用机制的深入研究，有望寻找到一种新的有效的抗AS药物，使之对广大男性患者也有效。

大量研究证实，血管内皮细胞（VECs）和血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖、迁移是AS形成过程中的关键环节[9]，血管内皮细胞在血管创伤修复、止血、血栓形成等一系列生理病理过程中起重要作用[4]，VECs的损伤和VSMC的异常增殖导致血管腔狭窄和痉挛是多种疾病（高血压、AS、等）发生发展的基础，加减一阴煎在兔体内经过生物转化后，在血清中产生有效成分，能促进血管内皮细胞增殖，维持内皮的完整性，又能抑制VSMC增殖，可见其具有血管的保护作用，但其对平滑肌增殖的抑制和对血管内皮的触增殖作用的途径和机制尚不清楚，有待进一步的研究。

在抑制平滑肌增殖实验中，当药血清量80ul时，其抑制增殖的作用降低。

其原因可能是由于80ul血清已经发挥最大的抑制增殖作用，同时由于血清本身对平滑肌细胞有营养增殖作用（由表二和图二，血清对照组结果表明血清也有血管触增殖作用），抵消了药血清有效成分的抑制作用。

本实验采用药血清法研究体外培养细胞的增值。

复方中药体外实验主要有两种方法，一种是将中药粗提物直接添加(如水煎液)作为作用细胞的处理因素，另一种是制成含药血清来作用细胞用于作用机理的研究。

两者方法各有优缺点[5]，大致认为直接添加有三方面缺点：

a.缺乏复方的体内代谢物或机体反应物等实际有效成分，引起假阴性；b.机体非吸收物质的体外作用，造成假阳性；c.粗提物理化性质如杂质、酸碱度、渗透压、pH值等对离体系的干扰。

而含药血清法具有两大优势：

a.体现复方药物的体内生化转化效应；b.克服药物本身理化性质对实验的直接干扰。

当然，含药血清也有其无法克服的缺点：

药物血清材料可来自各种不同生理病理状态的个体，会出现含药血清差异；而且经过体内反应，药物含量进一步被稀释，成分更加复杂，增加了质控难度。

血清中部分物质已是药物作用机体细胞的反应，如果细胞存在反馈机制，血清二次重复作用于细胞，将可能掩盖药物血清的实际作用。

含药血清对离体系统同样也有干扰，如血清本身对体外酶活性的影响等。

［6，7］但与直接加药法相比，血清药研究仍有很大的优越性。

参考文献1．谈智、王庭槐、杨丹等，17-雌二醇抑制内皮素诱导的血管平滑肌细胞增殖作用。

中国应用生理学杂志，2001，17（3）：

74～77。

2．钱振维，活血化瘀与冠心病，全国胸痹病（冠心病）学术研讨会论文集.1992.17.3．陈国姿、徐虹，中药人工周期法治疗卵巢功能早衰继发性闭经，广东医学，1999，4．高笑等，中药对血管内皮细胞的保护作用的研究概况，天津药学2003年4月，14卷2期5.刘成海.中药复方体外药理研究思考,中药新药与临床药理，2000，21（1）：

53～566.李仪奎.中药药血清理学实验方法的若干问题［J］.中药新药与临床药理，1999，10(2)：

95.7．贺玉琢.日本汉方药药血清理学、药血清化学的研究概况［J］.国外医学*中医中药分册，1998，20(5)：

3.8．AlkihikoS,kimioM,YasuhiI,etal.Effectof17-estrodiolandprogresteroneongrowth-factorinducedproliferationandmigrationinhumanfemaleaorticsmoothmusclecellsinvitro.CardiovascResearch.1996,32:5165282。

9．RossR.,etal.Cellbiologyofatherosclerosis.Annu.Rev.physiol.1995,57:791-804.三严三实开展以来，我认真学习了习近平总书记系列讲话，研读了中央、区、市、县关于党的群众路线教育实践活动有关文件和资料。

我对个人四风方面存在的问题及原因进行了认真的反思、查摆和剖析，找出了自身存在的诸多差距和不足，理出了问题存在的原因，明确了今后努力的方向和整改措施。

现将对照检查情况报告如下，不妥之处，敬请各位领导和同志们批评指正。

一、存在的突出问题一是学习深度广度不够。

学习上存在形式主义，学习的全面性和系统性不强，在抽时间和挤时间学习上还不够自觉，致使自己的学习无论从广度和深度上都有些欠缺。

学习制度坚持的不好，客观上强调工作忙、压力大和事务多，有时不耐心、不耐烦、不耐久，实则是缺乏学习的钻劲和恒心。

学用结合的关系处理的不够好，写文章、搞材料有时上网拼凑，求全求美求好看，结合本单位和实际工作的实质内容少，实用性不强。

比如，每天对各级各类报纸很少及时去阅读。

因而，使自己的知识水平跟不上新形势的需要，工作标准不高，唱功好，做功差，忽视了理论对实际工作的指导作用。

二是服务不深入不主动。

工作上有时习惯于按部就班，习惯于常规思维，习惯于凭老观念想新问题，在统筹全局、分工协作、围绕中心、协调方方面面上还不够好。

存在着为领导服务、为基层服务不够到位的问题，参谋和助手作用发挥得不够充分。

比如，到乡镇、部门、企业了解情况，有时浮皮潦草，不够全面系统。

与基层群众谈心交流少，没有真正深入到群众当中了解一线情况，掌握的第一手资料不全不深，书到用时方恨少，不能为领导决策提供更好的服务。

三是工作执行力不强。

日常工作中与办公室同志谈心谈话少，对干部思想状态了解不深，疏于管理。

办公室虽然制定出台了公文办理、工作守则等规章制度，但执行的意识不强，有时流于形式。

比如，办公场所禁止吸烟，这一点我没有严格执行，有时还在办公室吸烟。

四是工作创新力不高。

有时工作上习惯于照猫画虎，工作只求过得去、不求过得硬，存在着求稳怕乱的思想和患得患失心理，导致工作上不能完全放开手脚、甩开膀子去干，缺少一种敢于负责的担当和气魄。

比如，做协调工作，有时真成了传话筒和二传手，只传达领导交办的事项，缺乏与有关领导和同志共同商讨如何把事情做得更好，创造性地开展工作。

五是深入基层调查研究不够。

工作中，有时忙于具体事务，到基层一线调研不多，针对性不强，有时为了完成任务而调研，多了一些官气、少了一些士气。

往往是听汇报的多，直接倾听群众意见的少；了解面上情况多，发现深层次问题少。

比如，对县委提出的用三分之一时间下基层搞调研活动，在实际工作中却没有做到。

即使下基层，有时也是走马观花，蜻蜓点水，让看什么看什么，让听什么听什么。

在基层帮扶工作上，有时只注重出谋划策，抓落实、抓具体的少，对群众身边的一些小事情、小问题关心少、关注不够。

六是主观能动性发挥不够。

自认为在办公室工作多年，已经能够胜任工作，有自满情绪，缺乏俯下身子、虚心请教、不耻下问的态度。

对待新问题、新情况，习惯于根据简单经验提出解决办法，创新不足，主观上存在满足现状，不思进取思想，主观能动性发挥不够。

七是对工作细节重视不够。

作为办公室负责人，存在抓大放小，不能做到知上、知下、知左、知右、知里、知外，有时在一些小的问题上、细节上没有做好，导致工作落实不到位，出现偏差。

八是工作效率不是很高。

面对比较繁重的工作任务，工作有时拈轻怕重、拖拉应付、不够认真。

存在不推不动、不够主动，推一推动一动、有些被动。

比如，文稿材料的撰写，有时东拼西凑、生搬硬套、缺乏深入思考。

有时也存在着推诿扯皮现象，不能及时完成，质量也难以保证。

对于领导交办的事项，有时跟踪、督导的不够，不能及时协调办理，缺乏应有的紧迫感，缺乏开拓创新精神，致使工作效率不高。

二、产生问题的原因分析认真反思和深刻剖析自身存在的问题与不足，主要是自己没有加强世界观、人生观、价值观的改造，不注重提高自身修养，同时受社会不良风气的影响，在具体应对上没有很好地把握自己，碍于情面随波逐流。

产生问题的原因主要有以下几方面。

（一）自身放松了政治理论学习。

对政治理论学习的重要性认识不足，重视程度不够。

尤其是在处理工作与学习关系方面，把工作当成硬任务，把学习当作软指标，对政治理论学习投入的心思和精力不足，缺乏自觉学习的主动性和积极性。

（二）宗旨意识有所淡化。

由于乡镇工作比较辛苦，从基层回到机关工作后，产生了松口气的念头，有时不自觉产生了优越感和骄傲自满的情绪。

听惯了来自各方面的赞誉之声，深入基层少，对群众的呼声、疾苦、困难了解不够，没有树立较强的大局意识和责任意识，使得自己有时会片面地认为只要做好本职工作，完成领导交办的任务就行了，而未能完全发挥自身的主观能动性，缺乏做好工作应有的责任心和紧迫感。

（三）忧患意识不强。

只是片面看到了自身工作生活环境的变化，吃苦耐劳的精神有些缺乏，开拓进取、奋发有为、敢于冲锋、勇于担当的锐气有所弱化。

有做太平官的意识，身处领导岗位，求新、求发展意识薄弱，表率作用发挥得不够好，忽视了工作的积极性、主动性和创造性。

（四）勤政廉洁意识有所弱化。

随着自身经济条件的改善，降低了约束标准，勤俭节约的传统美德有些淡化，对奢靡之风的极端危害性认识不足，没有引起高度重视。

诚然，造成自身存在问题的原因远不止这些，还有很多，如自身的固化思维方式，缺乏居安思危的深层次思考等。

三、今后的努力方向和改进措施查摆问题，剖析根源，关键在于洗澡治病、解决问题。

本人决心从党性原则出发，端正态度、认真对待，在今后的工作中采取强有力措施，立行立改，取得实效。

（一）求真务实办公室主任作为承上启下、协调全局、沟通内外的重要角色，要立足发展、改革的新形势、新情况，以务实的作风和良好的品质做出表率。

一是增强大局意识。

要站在全局高度想问题，立足本职岗位做工作。

要注重换位思考，真正做到想领导之所想、谋领导之所谋，及早提出比较成熟的意见和建议，供领导决策参考。

要善于从纷繁复杂的事务性工作中解脱出来，理清思路，明确目标，发挥自己应有的作用。

二是增强超前意识。

要认真研究领会组织意图和领导思路，围绕领导关心的重大问题进行广泛深入的调查研究，为领导决策提供真实情况和可靠依据。

要广泛搜集资料，研究各乡镇、机关单位的新情况、新经验、新做法，借他山之石来攻玉，为领导提出决策预案。

因此，在想问题、办事情时，要赶前不赶后，尽可能早半拍、快半拍，提高敏感性，增强主动性。

唯其如此，才能变被动为主动，参谋才能参在点子上，助手才