L┐NAME对肝硬化大鼠胃肠道中一氧化氮合酶亚型表达的影响

1/1L┐NAME对肝硬化大鼠胃肠道中一氧化氮合酶亚型表达的影响L┐NAME对肝硬化大鼠胃肠道中一氧化氮合酶亚型表达的影响【关键词】大鼠关键词:大鼠;肝硬化;一氧化氮合酶;免疫组织化学;Westernblot摘要:目的研究一氧化氮合酶亚型（NOS1，NOS2，NOS3）在肝硬化大鼠胃肠道中的表达，并探讨NOS抑制剂左旋硝基精氨酸甲基酯（L-NAME）对其表达的影响.方法制作大鼠四氯化碳中毒肝硬化模型，肝硬化模型大鼠随机分为NO合酶（NOS）抑制剂治疗组和未治疗组，模型治疗组用L-NAME0.5mg#12539;kg-1#12539;d-1，胃内注入，每日1次，治疗10d.免疫组织化学染色显示胃肠道组织中各型NOS的染色强度和分布，Westernblot法检测胃肠道组织中各型NOS的表达.结果模型组大鼠胃、小肠、结肠组织中的NOS染色强度显著弱于正常对照组和L-NAME治疗组大鼠.Westernblot显示在肝硬化模型大鼠胃、小肠、结肠组织中的各型NOS表达均明显降低，L-NAME治疗后又恢复至接近正常.结论肝硬化大鼠胃肠道组织中各型NOS的表达明显减少，L-NAME对其表达有调节作用.Keywords:rat;livercirrhosis;nitricoxidesynthase;im-munohistochemistry;WesternblotAbstract:AIMToinvestigatetheeffectofL-NAMEonex-pressionofthenitricoxidesynthase（NOS）isoformsinthecirrhoticratintestine.METHODSRatswithcirrhosisin-ducedbycarbontetrachloridewererandomlydividedintotwogroups，onereceiving0.5mg#12539;kg-1#12539;d-1ofNG-nitro-L-argininemethylester（L-NAME）during10d，whereastheothergroupandcontrolwereadministratedthesamevolumeofsaline.ImmunohistochemicalSABCmethodwasusedtoobservetheexpressionanddistributionofthreeisoformsofNOSingastrointestinaltractofrats.WesternblottingwasusedtodetectexpressionofgastrointestinalNOSisoforms.RESULTSNOSisoformsstainingintensitiesweremarkedlylowerincirrhoticratintestinethanthecontrolandcirrhoticratsafterbeingtreatedwithL-NAME.CONCLUSIONEx-pressionsoftheNOSisoformsweresignificantlyreducedinthecirrhoticratintestine.MaybethereisaregulationofL-NAMEonexpressionofthegastrointestinalNOSisoformsincirrhoticrats.0引言NO作为一种神经递质和信使分子，具有多种生理功能，在神经传导和胃肠道功能调节中起重要作用［1-3］.NO与肝硬化胃肠运动、粘膜分泌、粘膜免疫功能有密切的关系［4-6］.我们应用NOS特异性抑制剂治疗肝硬化模型大鼠，观察其胃肠道NOS表达的变化，旨在探讨NOS在肝硬化大鼠胃肠道中的变化规律，为进一步研究NO在肝硬化胃肠道功能改变中的作用奠定基础.1材料和方法1.1材料实验动物为雄性SD大鼠（本校实验动物中心提供），共36只，体质量（25050）g，食用标准颗粒饲料，随机分为两组:模型组26只，正常对照组10只.按文献所述方法，制作四氯化碳（CCl4）中毒性肝硬化模型.模型组3mL#12539;kg-1CCl4腹部皮下注射，每周2次，共12wk;正常对照组3mL#12539;kg-1体质量橄榄油腹部sc，每周2次，共12wk.12wk末，肝硬化模型建立后随机分为治疗组和未治疗组，另取同批正常SD大鼠作为对照组，每组10只.模型治疗组用NOS抑制剂左旋硝基精氨酸甲基酯（L-NAME，Sigma产品），0.5mg#12539;kg-1#12539;d-1，ig;模型未治疗组和正常对照组用生理盐水灌胃，每日1次，均为10d.1.2方法常规40g#12539;L-1多聚甲醛液固定，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察肝脏组织改变.3组动物随机各取5只，10g#12539;L-1戊巴比妥钠50mL#12539;kg-1，ip麻醉后，开胸行左心室插管，先用冷生理盐水灌洗，再以40g#12539;L-1多聚甲醛灌注固定1.5h，迅速取小部分胃、小肠、结肠组织，移至200g#12539;L-1蔗糖液浸泡24h（4℃下），至组织完全沉底，在-20℃下行冰冻切片，厚度有14～16m（帖于载玻片上，37℃过夜）.用0.01mmol#12539;L-1PBS（pH7.4）洗5min3，过氧化氢甲醇处理15min，PBS振洗5min3，正常羊血清封闭30min后，加入兔抗NOS1（1∶100，兔多抗），NOS2（1∶100，兔多抗），NOS3（1∶100，兔多抗）在4℃孵育过夜.PBS振洗5min3，加入生物素化的羊抗兔IgG抗体，37℃30min.0.01mmol#12539;L-1PBS洗5min3，滴加试剂SABC，37℃30min.0.01mmol#12539;L-1PBS洗5min4，DAB显色（免疫组化试剂由武汉博士德生物工程有限公司提供）.苏木素复染后常规脱水透明，中性树胶封片，显微镜观察并照相.实验前12h禁食，不禁水.随机处死对照组、模型组和治疗组动物各3只，迅速剖腹分别取其胃，小肠和结肠，于冰盐水（含0.1mmol#12539;L-1PMSF）中清洗干净.立即液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存，此过程均在5min之内完成.配制三去污组织裂解液，去离子水配制，称量鼠胃肠组织，按每份组织加5份组织裂解液（m/V）的比例加入裂解液，于冰水中匀浆组织，3500r#12539;min-1，5s5，然后以10000g，离心10min，取上清分装贮存于-70℃备用于SDS和Westernblot分析，同时用Bradford法测定提取液中蛋白质浓度.灌制80g#12539;L-1的聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质样品加2SDS上样缓冲液，加热100℃3min，再次离心后上样等量的蛋白质样品.20mA恒流电泳，结束后凝胶用考马斯亮蓝R250染色.同时各组鼠的胃，小肠和结肠蛋白质提取物用8g#12539;L-1SDS进行分离，电泳结束后，用半干电转印仪（北京六一厂）将蛋白质电转印到硝酸纤维素膜上（转移缓冲液:25mmol#12539;L-1Tris-HCl，192mmol#12539;L-1甘氨酸，10g#12539;L-1SDS，20mL#12539;L-1甲醇，pH8.3）.0.8mA#12539;cm-2恒流转印1h，TBSpH7.5+50g#12539;L-1脱脂奶粉+0.5g#12539;L-1NP-40室温下封闭2h，用含0.1g#12539;L-1BSA的TBS缓冲液稀释兔抗NOS1（1∶100，兔多抗），NOS2（1∶100，兔多抗），NOS3（1∶100，兔多抗），4℃孵育16～18h，TBS洗10min3，TBS稀释HRP标记的羊抗兔（1∶400，博士德公司产品）二抗室温作用2h，TBS+1g#12539;L-1NP-40洗10min5，DAB显色.2结果模型大鼠肝、脾肿大，肝脏质地变硬，边缘钝，表面不光滑，有大小不等的小结节，光镜示肝细胞再生，脂肪变性，胶原纤维组织增生，有明显的假小叶形成.2.1胃肠道组织内NOSNOS免疫组织化学染色显示，NOS1，NOS2和NOS3在胃肠道粘膜固有层有相似的分布，主要存在于胃肠道粘膜固有层间质的中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和部分淋巴细胞.另外NOS1还存在于胃肠道壁内肌间神经丛，NOS2存在于粘膜下层血管内皮细胞.正常大鼠胃粘膜NOS阳性细胞主要靠近粘膜层下1/3，小肠在绒毛间质中，结肠则散在于粘膜绒毛间质中，上皮细胞均为阴性.而肝硬化大鼠胃肠道各段NOS阳性细胞数明显减少，胃粘膜NOS阳性细胞主要靠近粘膜层基底部.用L-NAME治疗的肝硬化大鼠胃肠组织中NOS阳性细胞数和神经丛中NOS染色强度明显强于肝硬化模型未治疗组（Fig1）.2.2SDS┐PAGE和Westernblot检测SDS显示各组大鼠胃，小肠和结肠的全层组织蛋白质构成比例是不同的，小肠组织中低分子量的蛋白质较多.而在不同组大鼠的同一组织中蛋白质构成比例却无明显差别（Fig2）.Westernblot显示肝硬化组大鼠胃，小肠和结肠组织中各型NOS的表达均是降低的.肝硬化大鼠经L-NAME治疗后胃肠道各段NOS表达又有所增加.但各组大鼠小肠中均未检测出NOS1和NOS3，肝硬化大鼠小肠中甚至未检测出NOS2（Fig3A～D）.3讨论NOS是NO合成的关键限速酶，广泛存在全胃肠道组织中，根据NOS生物学特性和编码基因不同可分3型.神经元型nNOS（NOSⅠ），内皮型eNOS（NOSⅢ）和诱生型iNOS（NOSⅡ），它们之间有50%的同源性.NOSⅠ主要存在于神经细胞和上皮细胞;NOSⅡ最初是从巨噬细胞分离出来的，后来发现他们也存在于其他细胞，如血管平滑肌细胞;NOSⅢ主要存在于血管内皮细胞.根据NOS酶活性对Ca2+/CaM的依赖性不同将NOS分为2类，一类是构建型NOS（cNOS），NOSⅠ和NOSⅢ都属于此类，其活性受Ca2+/CaM的调控，使NO的释放呈间歇、脉冲式发挥对机体的保护作用.cNOS主要存在于正常血管内皮细胞，亦存在于肾上腺、血小板、成纤维细胞、PMN、脑以及某些非胆碱能非肾上腺素能神经末稍.另一类是诱生型NOS（iNOS），NOSⅡ属于此类，其酶活性不依赖于Ca2+/CaM，但需要有诱导因子的存在.iNOS主要存在于内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、多形核白细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肝细胞、肥大细胞和肾基底膜细胞等［7-11］.在某些病况下，胃肠道组织中NOS表达不同.腹腔炎性病时，小肠壁内iNOS阳性细胞主要分布在粘膜固有层，80%以上为CD45阳性的各类炎性细胞，约15%为CD3阳性的T淋巴细胞，而上皮细胞均为阴性［12］;溃疡性结肠炎时，iNOS阳性细胞主要分布在肠上皮细胞，粘膜固有层细胞均为阴性［13］，肝硬化时尚不清楚.我们的研究显示，NOS1，NOS2和NOS3在胃肠道粘膜固有层有相似的分布，主要存在于胃肠道粘膜固有层间质的中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和部分淋巴细胞.另外NOS1还存在于胃肠道壁内肌间神经丛，NOS2存在于粘膜下层血管内皮细胞.正常大鼠胃粘膜NOS阳性细胞主要靠近粘膜层下1/3，小肠在绒毛间质中，结肠则散在于粘膜绒毛间质中，上皮细胞均为阴性.而肝硬化大鼠胃肠道各段NOS阳性细胞数明显减少，胃粘膜NOS阳性细胞主要靠近粘膜层基底部.用L-NAME治疗的肝硬化大鼠胃肠组织中NOS阳性细胞数和神经丛中NOS染色强度明显强于肝硬化模型未治疗组.提示肝硬化时大鼠胃肠道各段NOS表达减少，而L-NAME灌胃治疗10d后胃肠道各段NOS表达又有所增加.我们用Westernblot方法检测了各组大鼠胃，小肠和结肠的全层组织中各型NOS的表达，表明与NOS免疫组织化学染色一致，因而表明肝硬化大鼠胃肠道各段NOS（cNOS和iNOS）表达是降低的.L-NAME是NOS的特异性拮抗剂，可抑制NOS的活性，减少NO的合成.文献及我们以往的研究显示肝硬化患者及大鼠血清中NO的水平是升高的，用L-NAME治疗后血清中NO的水平下降，而我们的NOS免疫组织化学染色及Westernblot结果却显示肝硬化大鼠经L-NAME治疗后胃肠道各段NOS表达又有所增加，提示肝硬化时大鼠胃肠道各段NOS的表达可能受到血清及门脉中NO水平的反馈调节.参考文献:［1］StarkME，SzurszewskiJH.Roleofnitricoxideingastroin-testinalandhepaticfunctionsanddisease［J］.Gastroenterology，1992;103:1928-1949.［2］EkbladE，MulderH，UddmanR，SundlerF.NOS-containingneuronsintheratgutandcoeliacganglia［J］.Neuropharma-cology，1994;33（11）:1323-1331.［3］JarvinenMK，WollmannWJ，PowrozekTA，SchultzJA，Pow-leyTL.Nitricoxidesynthase-containingneuronsinthemyen-tericplexusoftheratgastrointestinaltract:Distributionandre-gionaldensity［J］.AnatEmbryolBerl，1999;199（2）:99-112.［4］SalzmanAL.Nitricoxideinthegut［J］.NewHoriz，1995;3（2）:352-364.［5］AlicanI，KubesP.Acriticalrolefornitricoxideinintestinalbarrierfunctionanddysfunction［J］.AmJPhysiol，1996;270:G225-G237.［6］RussoA，FraserR，AdachiK，HorowitzM，BoeckxstaensG.Evidencethatnitricoxidemechanismsregulatesmallintestinalmotilityinhumans［seecomments］［J］.Gut，1999;44（1）:72-76.［7］TengB，MurthyKS，KuemmerleJF，GriderJR，SaseK，MichelT，MakhloufGM.Expressionofendothelialnitricoxidesynthaseinhumanandrabbitgastrointestinalsmoothmusclecells［J］.AmJPhysiol，1998;275（2Pt1）:G342-G351.［8］BarbiersM，TimmermansJP，ScheuermannDW，AdriaensenD，MayerB，DeGroodt-LasseelMH.Nitricoxidesynthase-containingneuronsinthepiglargeintestine:Topography，mor-phology，andviscerofugalprojections［J］.MicroscResTech，1994;29（2）:72-78.［9］NicholsK，StainesW，KrantisA.Nitricoxidesynthasedistri-butionintheratintestine:Ahistochemicalanalysis［J］.Gas-troente