人教版选择性必修三基因工程的基本操作程序课件（共66张）

第2节基因工程的基本操作程序目标素养1.运用归纳与概括、模型与建模等方法,分析基因工程操作的四个步骤。2.通过对基因工程案例的分析,理解基因工程基本操作程序的常用方法和基本原理,培养科学思维和科学探究能力。3.尝试用PCR技术扩增目的基因,并通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物,培养动手能力。知识概览一、目的基因的筛选与获取1.目的基因在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞

性状

或获得

预期表达产物

等的基因。目的基因主要是指

编码蛋白质

的基因。

2.筛选合适的目的基因从相关的已知

结构

和

功能

清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。

3.利用PCR获取和扩增目的基因(1)原理:根据

DNA半保留复制

的原理,在体外提供参与DNA复制的

各种组分与反应条件

,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。

(2)组分和条件:缓冲溶液、

DNA模板

、2种

引物

、4种

脱氧核苷酸

、耐高温的

DNA聚合

酶,同时控制温度。(3)过程:①

变性

:当温度超过90℃时,双链DNA解聚为

单链

。②

复性

:当温度下降到50℃左右时,两种

引物

通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

③

延伸

:当温度上升到72℃左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的

DNA聚合酶

的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

如此重复循环多次。(4)特点:成

指数

形式扩增。

4.在获得转基因产品的过程中,还可以通过构建基因

文库

来获取目的基因。

微点拨用PCR技术扩增DNA不需要解旋酶;PCR技术需要的DNA聚合酶能耐高温,具有热稳定性。二、基因表达载体的构建1.构建基因表达载体的目的(1)让目的基因在受体细胞中

稳定存在

,并且遗传给下一代。

(2)使目的基因能够

表达

和发挥作用。

2.基因表达载体的组成

3.基因表达载体的构建过程首先用一定的

限制酶

切割载体,使它出现一个切口;然后用同种限制酶或能产生

相同末端

的限制酶切割含有

目的基因

的DNA片段;再利用

DNA连接酶

将目的基因片段拼接到载体的切口处,形成一个

重组DNA

分子。

微思考1目的基因表达时,RNA聚合酶识别和结合的部位在哪里?提示:目的基因表达时,RNA聚合酶识别和结合的部位是启动子。三、将目的基因导入受体细胞1.导入植物细胞(1)常用:

农杆菌转化

法。

(2)我国独创:

花粉管通道

法。

2.导入动物细胞(1)方法:

显微注射

技术。

(2)常用受体细胞:

受精卵

。

3.导入微生物细胞(1)常用方法:先用

Ca2+

处理受体细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中。

(2)常用受体细胞:原核细胞,最广泛的是

大肠杆菌

细胞。微判断1将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术。(

)√四、目的基因的检测与鉴定1.分子水平的检测(1)通过

PCR

等技术检测生物体的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了

mRNA

。(2)从转基因生物体中提取蛋白质,用相应的抗体进行

抗原—抗体杂交

,检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质等。2.个体生物学水平的鉴定例如,通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。微思考2基因工程操作的四个步骤中,哪些步骤没有发生碱基互补配对?提示:只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有发生碱基互补配对。第一步,碱基互补配对发生在PCR扩增目的基因的过程中。第二步,碱基互补配对发生在目的基因片段相互拼接的过程中。第四步,碱基互补配对发生在目的基因的导入检测和转录检测过程中。微判断2抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上,也未必能正常表达。(

)√五、DNA片段的扩增及电泳鉴定1.原理(1)PCR利用了DNA的

热变性

原理,通过调节温度来控制DNA双链的

解聚与结合

。PCR仪实质上就是一台能够自动

调控温度

的仪器。一次PCR一般要经历

30

次循环。

(2)DNA分子具有

可解离的基团

,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。(3)PCR的产物一般通过

琼脂糖凝胶电泳

来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的

浓度

、

DNA分子的大小

和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过

染色

,可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。

2.方法步骤

一

目的基因的筛选与获取重难归纳1.目的基因的筛选是根据基因的有关信息,包括基因的核苷酸序列、基因的位置、基因的表达产物等,借助测序技术、序列对比工具以及序列数据库的辅助进行筛选。2.PCR反应过程

特别提醒关于引物的三点提示(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,作为DNA复制的起始点,只能结合在DNA母链的3'端。(2)在细胞外的条件下,只有通过引物,DNA才可以开始进行复制。(3)引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段。在核酸分子杂交技术中,常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针,用于检测目标核苷酸序列是否存在。为了获得某DNA单链作探针,可应用PCR进行扩增。PCR与生物体内DNA复制有区别吗?请列表格进行比较。提示:典例剖析下列有关PCR的叙述,正确的是(

)A.作为模板的DNA序列不能在每次扩增中重复使用B.作为引物的脱氧核苷酸序列不能在每次扩增中重复使用C.反应需要的DNA聚合酶不能在每次扩增中重复使用D.反应需要的DNA连接酶不能在每次扩增中重复使用答案:B解析:PCR中作为模板的DNA序列可反复在每一次循环中用作模板,A项错误。反应过程中需要的DNA聚合酶可重复使用,C项错误。反应过程中不需要DNA连接酶,D项错误。学以致用下列关于PCR的叙述,错误的是(

)A.可在短时间内大量扩增目的基因B.利用的是DNA半保留复制的原理C.目的基因的核苷酸序列需全部已知D.每一次循环后目的基因的量可以增加一倍答案:C解析:知道要扩增的目的基因及其两端的核苷酸序列,就可通过PCR扩增目的基因。二

基因表达载体的构建重难归纳1.基因表达载体的构建过程特别提醒质粒和重组质粒是两个不同的概念,插入目的基因的质粒称为重组质粒。2.需要注意的问题(1)表达载体不等于载体:表达载体在载体的基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。(2)启动子不等于起始密码子,终止子不等于终止密码子:启动子和终止子位于DNA片段上,分别控制转录的启动和终止;起始密码子和终止密码子位于mRNA上,分别控制翻译的启动和终止。(3)目的基因的插入位点不是随意的:基因表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插到启动子与终止子之间的部位。目的基因的插入不能破坏标记基因。特别提醒(1)完成基因表达载体的构建需要限制酶和DNA连接酶,由两个DNA片段连接的产物有目的基因—目的基因、目的基因—载体、载体—载体三种。(2)切割质粒和获取目的基因的限制酶必须产生相同的末端。这样形成的末端的碱基之间互补,便于连接。(3)为了避免目的基因与目的基因连接、载体与载体连接以及目的基因自身环化,可以同时用不同的限制酶切割。科学家构建了含有大洋鳕鱼抗冻蛋白基因启动子和大鳞鲑鱼生长激素基因的表达载体,并将其导入了大西洋鲑的细胞中,获得了生长速度加快的转基因大西洋鲑。(1)在构建基因表达载体时,用限制酶切割载体和获取目的基因时需注意哪些问题?提示:①获取目的基因和切割载体时,使用同一种限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶),目的是产生相同的黏性末端或平末端。②选择限制酶切割位点时,必须保证标记基因的完整性。限制酶切割位点应位于标记基因之外,不能破坏标记基因,以便于检测。③获取一个目的基因需要限制酶切割两次,共产生四个黏性末端或平末端。(2)切割质粒和获取目的基因是不是只能用同一种限制酶?提示:不是。如果用两种不同限制酶切割后形成的末端相同,在DNA连接酶的作用下,目的基因与载体也可以连接起来。典例剖析下列关于构建基因表达载体的叙述,错误的是(

)A.基因表达载体的构建是基因工程的核心B.基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分C.目的基因主要是指编码蛋白质的基因D.构建的基因表达载体都是相同的

解析:由于受体细胞不同,基因表达载体的构建也会有差别,不可能都是相同的。D学以致用下图为基因表达载体的模式图。若结构X是表达载体所必需的,则X最可能是(

)A.氨苄青霉素抗性基因 B.启动子C.限制酶

D.DNA连接酶答案:B解析:启动子是该表达载体所必需的,其功能是驱动基因的转录过程。三

将目的基因导入受体细胞重难归纳1.目的基因导入受体细胞的过程特别提醒(1)目的基因在受体细胞内能否稳定维持并表达的关键是目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上。图中过程b与过程a相比,过程b会使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达,而过程a细胞分裂时,细胞质是不均分的,子细胞中不一定含有目的基因。(2)目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为转化。2.将目的基因导入受体细胞的方法(1)常用方法:受体类型植物动物大肠杆菌转化过程将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的染色体DNA中提纯含目的基因的表达载体→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的转基因动物先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中特别提醒(1)将目的基因导入植物细胞,常采用农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。(2)用Ca2+处理细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞。(2)农杆菌转化法分析:①完成基因表达载体的构建,需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶。②由棉株细胞形成抗虫棉需要运用植物组织培养技术。特别提醒农杆菌转化法适用于向双子叶植物和裸子植物导入目的基因。向单子叶植物导入目的基因可用基因枪法。某研究所的研究人员将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内,使其表达产生大量生长激素,应用于侏儒症的早期治疗。而α1-抗胰蛋白酶缺乏症是一种单基因遗传病,患者成年后会出现肺气肿及其他疾病,严重者甚至死亡。利用基因工程技术将控制该酶合成的基因导入羊的受精卵,最终培育出能在乳腺细胞表达人α1-抗胰蛋白酶的转基因羊,从而更容易获得这种酶。基因工程技术中受体细胞的选择有什么原则?提示:①植物:由于植物细胞具有全能性,植物体细胞经过植物组织培养能够形成生物体,所以植物基因工程的受体细胞一般是体细胞。②动物:由于动物细胞没有全能性,所以动物基因工程的受体细胞不是体细胞,而是受精卵。③微生物:常用原核生物,因为原核生物繁殖快,多为单细胞,遗传物质相对较少。④如果要合成有生物活性的蛋白质如胰岛素等,则必须用真核生物酵母菌(需内质网和高尔基体的加工、分泌)作为受体细胞,不能用哺乳动物成熟的红细胞,原因是无细胞核,也不能合成蛋白质。典例剖析采用基因工程的方法培养抗虫棉,下列导入目的基因的做法正确的是(

)①将Bt抗虫蛋白注射到棉花受精卵中②将编码Bt抗虫蛋白的DNA序列注射到棉花受精卵中③将编码Bt抗虫蛋白的DNA序列与质粒重组导入细菌,用该细菌感染棉花体细胞,再进行组织培养④将编码Bt抗虫蛋白的DNA序列与质粒重组,注射到棉花子房,并进入受精卵A.①②

B.②③

C.③④

D.①④

C解析:将Bt抗虫蛋白直接注射到棉花受精卵中,受精卵没有获得目的基因,子代细胞不会有抗虫性状,①错误。将编码Bt抗虫蛋白的DNA序列直接注射到棉花受精卵中,而没有将目的基因与载体结合,目的基因很容易被水解掉,②错误。在植物基因工程中,利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞,然后通过植物组织培养技术将植物细胞培养成完整植株,③正确。在植物基因工程中,可以利用花粉管通道法将目的基因导入棉花受精卵中,然后发育为转基因植株,④正确。学以致用下列有关将目的基因导入受体细胞的叙述,错误的是(

)A.将目的基因导入棉花细胞内常用花粉管通道法B.将目的基因导入小鼠受精卵内常用显微注射技术C.将目的基因导入大肠杆菌内常用Ca2+处理法D.将目的基因导入小麦细胞内常用农杆菌转化法答案:D解析:小麦是单子叶植物,农杆菌对它没有侵染能力。四

目的基因的检测与鉴定重难归纳目的基因的检测与鉴定类型步骤检测内容方法分子水平检测第一步转基因生物的DNA上是否插入了目的基因PCR等技术第二步目的基因是否转录出了mRNAPCR等技术第三步目的基因是否翻译成蛋白质抗原—抗体杂交技术1997年,我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年,我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个,减少农药用量约40万吨,增收节支社会经济效益约450亿元。(1)检测棉花中导入的抗虫基因是否表达,最简便的方法是什么?提示:用棉花叶片饲养棉铃虫,观察棉铃虫是否死亡。(2)用什么方法检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA?提示:PCR等技术。(3)如果棉花中插入的Bt基因转录成功,是否就一定能够翻译出相应的蛋白质呢?如何从分子水平进行检测?提示:不一定翻译出相应的蛋白质。可从转基因棉花中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。知识拓展DNA分子杂交技术,即将转基因生物的基因组DNA提取出来,在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记,以此作为探针,使探针与基因组DNA杂交,如果显示出杂交带,就表明目的基因已插入染色体DNA中。典例剖析下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达?(

)A.显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因B.在含某种抗生素的培养基中培养导入了重组质粒的大肠杆菌C.利用相应的DNA探针与受体细胞DNA分子进行杂交D.提取受体细胞的蛋白质,利用抗原—抗体特异性反应进行检测

A解析:在显微镜下无法观察到基因,因此该方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达。学以致用将苏云金杆菌的Bt基因导入棉花植株后,从个体生物学水平进行鉴定时应鉴定其(

)A.是否有抗药性B.是否有相应的抗虫性状C.是否能检测到标记基因D.是否能分离到目的基因答案:B1.下面是基因工程的基本操作程序,正确的排序是(

)①使目的基因与载体相结合②将目的基因导入受体细胞③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求④提取目的基因A.③②④①

B.②④①③C.④①②③

D.③④①②答案:C2.PCR是一种DNA扩增技术,其基本原理和过程与细胞内DNA的复制类似。下列关于两者共同点的叙述,正确的是(

)①边解旋边复制

②遵循碱基互补配对原则③需要引物

④过程可分为变性、复性、延伸等步骤A.①②

B.②③C.③④

D.①④答案:B3.基因工程的核心是(

)A.目的基因的获取B.基因表达载体的构建C.将目的基因导入受体细